Apelin-13对LPS诱导人脐静脉内皮细胞屏障损伤的干预作用*

林道朋， 陈 莎， 陆溧玲， 王 玉， 吕芳芳， 施林微， 孔晓霞， 单小鸥， 张海邻△

((1. 温州医科大学附属第二医院育英儿童医院， 浙江 温州 325035； 2. 鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院病理科)， 湖北 黄石 435000； 3. 温州医科大学基础医学院低氧研究所， 浙江 温州 325035)

血管内皮细胞位于血管壁内侧，形成半选择性的通透屏障，调节血浆蛋白、溶质、液体和炎症细胞的转运[1]。血管内皮细胞损伤引起的内皮屏障破坏，内皮通透性增加是许多急慢性炎症性疾病发病机制中必不可少的组成成分，包括急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、动脉粥样硬化[2, 3]等。因此保护内皮细胞、维持细胞屏障在屏障功能受损相关疾病中具有重要的作用。

Apelin-13是一种新近发现的生物活性肽，是G蛋白耦联受体-血管紧张素受体AT-1相关蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin recetor AT-1, APJ)的内源性配体[4]。Apelin-13 具有抗炎[5]、保护内皮细胞[6]、改善肺动脉高压[7, 8]等功能。同时有报道指出，Apelin-13能调节血管再生[9]以及保护血脑屏障[10]。然而，Apelin-13保护内皮细胞屏障的具体机制还尚未阐明。因此，本研究应用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，通过给予脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)复制内皮细胞屏障功能受损模型，观察Apelin-13对其保护及其具体机制，为内皮屏障功能受损及血管炎症相关疾病的防治提供新的思路和潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

HUVECs购自中国科学院上海细胞库；Endothelial Cell Medium(ECM)培养基购自ScienCell公司；LPS和Apelin-13购自美国Sigma公司；VE-cadherin抗体、NF-κBp65抗体、F-actin抗体及GAPDH抗体购自Abcam公司；BCA蛋白浓度试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；CCK8试剂盒购自日本DOJINDO公司。

1.2 HUVECs培养

配制完全培养基(5%的胎牛血清，1%生长因子，1%青霉素、链霉素双抗，93%基础ECM培养基)。HUVECs细胞在37℃，5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，待90%融合状态传代及后续细胞活力、细胞蛋白表达检测。

1.3 实验分组及模型制备

细胞随机分成Control组、LPS组、Apelin-13+LPS组、Apelin-13组。LPS溶于无菌生理盐水，应用培养基稀释浓度为5 μg/ml，时间作用24 h，复制屏障功能受损模型。Apelin-13溶于无菌生理盐水，经培养基稀释，浓度为1 μmol/L。Apelin-13提前30 min给予，再给予LPS作用24 h，确定Apelin的保护作用。

1.4 CCK8检测细胞活力

选择对数期生长细胞，以1×104cells/well的密度铺于96孔板中(5复孔)，置于细胞培养箱中过夜，予以LPS(0.01 μg/ml、0.1 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml)及Apelin-13(0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L)处理24 h，进行药物浓度筛选。给药结束后用无菌PBS洗涤孔板2～3次，倾去多余液体，每孔板中加入100 μl基础培养基，再加入10 μl CCK8溶液，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育2～4 h。多功能酶标仪在波长450 nm处测定各组OD值。实验重复4次。

1.5 Western blot检测蛋白表达

无菌4℃预冷的PBS洗涤细胞三次，每次5 min。RIPA蛋白裂解液(RIPA缓冲液与蛋白酶抑制剂PMSF按100∶1比例配制)，以100 μl/well加入6孔板中。用蛋白刮刀刮取细胞中的蛋白质，收集于EP管中，12 000 r/min，4℃，10 min离心，吸取上清，弃沉淀。BCA试剂盒测定蛋白浓度。各管加入4×Loading Buffer，置于100℃，水浴10 min。SDS-PAGE电泳分离蛋白，湿转法转移蛋白至PVDF膜上。脱脂牛奶封闭1.5 h，TBST洗涤3次，每次5 min。分别加入特异性抗VE-cadherin、抗F-actin抗体及抗内参GAPDH抗体，4℃过夜。次日，TBST洗涤3次，每次5 min。加入髓过氧化物酶标记的相应二抗，室温摇床孵育1 h，TBST洗涤3次，每次5 min。曝光液按照A液∶B液=1∶1配制，均匀滴在膜上，Bio-Rad凝胶成像系统拍照。应用Image J图像处理软件分析相应条带灰度值，计算各组目的蛋白相对表达量。

1.6 免疫荧光检测蛋白表达

在6孔板内放入无菌清洁盖玻片，接种1×105cells/well，贴壁后给予药物处理。PBS洗三次，每次5 min。滴加4%多聚甲醛，于冰上固定40 min。弃去多聚甲醛，在空气中完全干燥，PBS洗3次，每次2 min。固定盖玻片四角，0.1%Triton打孔20 min，PBS洗3次，每次2 min。用于封闭的5%BSA滴加于载玻片上，静置30 min。1%BSA配制的一抗4℃孵育过夜。室温下复温30 min，PBS洗3次，每次2 min。1%BSA配制的二抗室温避光孵育2 h，PBS洗3次，每次2 min。DAPI避光染细胞核5 min，PBS洗3次，每次5 min。抗荧光猝灭剂封片，荧光显微镜拍片。实验重复3次。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 Apelin-13对LPS诱导的人脐静脉内皮细胞活力的影响

CCK8检测细胞活力结果显示：与正常对照组相比，不同浓度(1、5、10 μg/ml)LPS作用于细胞24 h，细胞活力明显下降，具有统计学意义(P<0.01)，而LPS在浓度0.01和0.1 μg/ml对细胞活力无明显影响。本实验选择5 μg/ml LPS做后续实验(表1)。而与LPS组相比，不同浓度(0.1 μmol/L、0.5 μmol/L和1 μmol/L)Apelin-13对LPS诱导的细胞活力降低均具有改善作用(P<0.01)，本实验选择效果最显著的药物浓度为1 μmol/L Apelin-13做后续实验。与正常对照组相比，单独使用Apelin-13，不同浓度Apelin-13对细胞活力无明显影响(表2)。

Tab. 1 Cell viability in different concentrations of LPS for 24 h(OD, n=4)

Tab. 2 Effects of Apelin-13 on viability of HUVECs induced by LPS(OD, n=4)

2.2 Apelin-13对LPS诱导的人脐静脉内皮细胞屏障功能损伤相关蛋白影响

Western blot检测各组VE-cadherin、F-actin蛋白的表达，结果显示：与对照组相比，LPS组的黏附连接蛋白VE-cadherin的表达量下降(P<0.01)，构成应力纤维的F-actin表达量上升(P<0.05)，而Apelin-13干预后，显著改善LPS诱导的蛋白VE-cadherin(P<0.05)和F-actin(P<0.01)的表达改变(图1，表3)。

Fig. 1 Protein expressions of VE-cadherin and F-actin measured by Western blot

Tab. 3 Relative expression levels of VE-cadherin and F-actin in HUVECs n=3)

2.3 Apelin-13对LPS诱导的人脐静脉内皮细胞屏障功能损伤相关蛋白表达的影响

免疫荧光检测结果显示：与正常对照组相比，LPS组细胞膜表面VE-cadherin表达减少，细胞间连接连续性中断，且F-actin聚集增多，应力纤维形成增加(箭头)，排列紊乱，细胞间隙增大(三角形)。与LPS组相比，Apelin-13干预后，改善LPS诱导的细胞间VE-cadherin连续性受损(箭头)，减轻F-actin聚集，缓解细胞间隙增大。单独给予Apelin-13处理，与对照组无明显差异(图2)。

Fig. 2 Protein expressions of F-actin and VE-cadherin were measured by immunofluorescence

2.4 Apelin-13对LPS诱导的人脐静脉内皮细胞NF-κB入核影响

免疫荧光检测各组细胞中NF-κB p65入核情况，结果显示：与正常对照组相比，LPS显著增加NF-κB p65的入核；而与LPS组相比，给予Apelin-13后，明显减轻LPS对NF-κB p65的入核作用；单独给予Apelin-13与正常对照组无明显差异(图3)。

Fig. 3 Apelin-13 attenuated the nuclear translocation of NF-κB induced by LPS in HUVECs

3 讨论

血管内皮细胞构成内皮屏障，发挥重要作用，如调节血管张力，防止炎性细胞、血细胞渗出等，是维持组织、器官功能的要素之一[11]。血管内皮细胞功能失调导致的屏障功能受损是多种疾病病理特点[12,13]。因此，寻找保护内皮细胞及维持其屏障功能的药物对疾病的治疗具有重要意义。

Apelin是一种新近发现的生物活性肽，在心、肺、脑、肾等组织均有表达，主要以Apelin-13和Apelin-36两种形式存在[4]。有研究表明，Apelin-13在多种疾病中具有保护作用，可明显改善油酸及LPS诱导的大鼠急性肺损伤[14, 15]。同时可通过抑制肺血管平滑肌增殖，改善肺动脉高压[16]。但其对内皮屏障功能的作用及机制还尚不明确。本实验通过LPS诱导HUVECs损伤及屏障功能受损，检测Apelin-13的保护作用。首先通过CCK8法检测细胞生存率，结果表明，给予Apelin-13干预明显减轻细胞损伤，增加细胞存活率。在细胞水平上，Apelin-13对LPS损伤的HUVECs具有保护作用。

细胞间连接中的黏附连接在维持细胞内皮屏障功能起着关键的作用[17]。VE-cadherin胞内段特定结构域通过连环蛋白Catenin与细胞骨架蛋白F-actin相连，构成粘附连接。当内皮细胞受损时，发生黏附连接结构受损，内皮通透性增加[18]。本研究Western blot结果表明， LPS作用于HUVECs内皮细胞，VE-cadherin总蛋白表达量下降，骨架蛋白F-actin的表达量上调。免疫荧光结果进一步证明，细胞间VE-cadherin蛋白表达下降，连接连续性中断，细胞内应力纤维形成增多，排列紊乱，黏附连接破坏，细胞间隙变大。Apelin-13明显改善细胞间VE-cadherin连续性中断及细胞F-actin骨架的破坏。因此，Apelin-13的屏障保护作用可能与调节VE-cadherin等内皮细胞间连接相关蛋白有关。

有研究表明，过度激活的炎症反应导致肺微血管内皮细胞屏障功能受损在急性肺损伤中发挥着举足轻重的作用[19]。伽马射线可以通过MAPK/NF-κB途径破坏HUVECs细胞连接，导致VE-cadherin，ZO-1蛋白降低，通透性增加[20]，暗示炎症反应可能是导致内皮屏障功能受损的重要因素之一。本研究通过免疫荧光检测NF-κB p65入核，结果显示，Apelin-13减弱LPS促进NF-κB p65入核作用，说明Apelin-13抑制LPS诱导的内皮细胞炎症。据此，我们推测Apelin-13对内皮黏附连接的保护作用可能与抑制NF-κB入核有关，但具体作用机制仍需进一步研究证明。

综上所述，我们推测，在LPS诱导的HUVECs细胞损伤及屏障功能受损中，炎症反应是损伤内皮屏障功能的重要因素。应用Apelin-13可以改善LPS诱导的HUVECs屏障的损伤，其保护作用可能与抑制炎症相关。这为内皮屏障受损相关疾病的治疗和新药开发提供新的理论依据。