T16Ainh-A01对耳蜗血管纹毛细血管内皮细胞凋亡及衰老的影响*

冯子奕, 李雪蕊, 陈 龙, 周 颖, 常越辰, 马克涛, 司军强, 李 丽

(1. 石河子大学医学院生理教研室， 石河子 832002； 2. 武汉市中心医院， 武汉 430000； 3. 石河子大学医学院教学实验中心， 石河子 832002； 4. 嘉兴学院医学院， 嘉兴 314000)

老年性耳聋(presbycusis)已成为严重影响老年人生活质量的退行性疾病[1]，其中耳蜗血管纹萎缩是影响老年性耳聋的重要因素之一。前期本实验室研究发现钙激活氯离子通道(calcium-activated chloride channels, CaCCs)的主要组成蛋白跨膜蛋白16A(TMEM16A)在豚鼠耳蜗血管纹上广泛表达[2]。内皮细胞(endothelial cells, ECs)作为组成耳蜗血管纹毛细血管网的重要细胞，对维持耳蜗内电位稳态具有重要意义[3, 4]。本实验发现耳蜗血管纹毛细血管ECs上广泛表达TMEM16A，但其具体功能意义尚不清楚。本文通过观察耳蜗血管纹毛细血管ECs衰老过程中TMEM16A的变化，给予特异性阻断剂T16Ainh-A01后观察ECs凋亡及衰老的改变，从而探讨TMEM16A是否参与豚鼠耳蜗血管纹毛细血管ECs的凋亡和衰老过程，为老年性耳聋的防治提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2周龄左右的新生杂色豚鼠，雌雄不拘，体重约在200 g，购自于新疆医科大学动物实验中心(动物实验设施许可证编号：CXK New 2003-0001),所有实验均严格遵守《石河子大学医学院第一附属医院动物实验伦理委员会条例》。

1.2 主要试剂

戊巴比妥钠(上海生工)；ECM培养基(Sciencell，美国)；胎牛血清、青霉素和链霉素(Gibco，美国)；CCK-8(日本同仁)；衰老相关β-半乳糖苷酶测定试剂盒(碧云天)；DMSO (Sigma,美国)；小鼠抗β-actin单抗(Thermo，美国)；Anti-vWF抗体、Anti-Bcl-2抗体、Anti-casepase-3抗体、Anti-Bax抗体、Anti-TMEM16A抗体，驴抗羊IgG二抗；T16Ainh-A01 (Abcam公司，英国)；山羊抗兔二抗，山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔IgG/FITC标记二抗(北京中杉金桥，中国)、Annexin V-FITC试剂盒(杭州联科生物，中国)。

1.3 主要仪器

非接触式激光共聚焦显微镜(LSM510)(Carl Zeiss公司，德国)；凝胶成像仪(UVP公司，美国)；流式细胞仪(BD公司，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；酶标仪(BIO-RAD，美国)；ECL化学发光仪(美国Protein Simple公司)。

1.4 豚鼠耳蜗血管纹毛细血管ECs培养

选取2周龄重约200 g左右杂色豚鼠，用1%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，迅速取出双侧耳蜗并放入装有无菌D-HANKs液的培养皿中，解剖显微镜下用眼科镊去除听泡外侧壁，取出缠绕在蜗轴的软组织，分离深褐色血管纹，将其撕碎呈0.15～0.2 mm2大小，并平铺于含有内皮选择性ECM培养基的35 mm2的培养皿中，置于5% CO2，37℃培养箱中培养，前两天不更换液体，培养48 h，细胞沿组织边缘爬出，每2 d更换1/2培养基，待培养第12日细胞密度达到90%时，细胞按1∶2进行传代，最后以 1.5×104cells/ml密度接种于60 mm2含ECM培养基的培养皿中。

1.5 豚鼠耳蜗血管纹毛细血管ECs鉴定

将细胞接种在盖玻片上进行爬片，弃去培养基，用PBS缓慢洗涤，用4%多聚甲醛固定，PBS洗涤后加入0.2%Triton-100破膜，PBS洗涤后加入5%BSA封闭，加入1∶100抗驴vWF抗体4℃湿盒过夜，PBS洗涤三次后避光加入驴抗羊荧光二抗，37℃温箱孵育1～2 h，PBS洗涤后加入DAPI，温箱孵育15 min，封片，荧光显微镜下观察。

1.6 耳蜗血管纹毛细血管ECs衰老模型的建立

取第1代细胞连续传代，构建复制性衰老模型，通过CCK-8及SA-β-gal活性评价第3代、第6代、第9代、第12代、第15代细胞活性及衰老细胞比例来筛选衰老细胞代数。

1.6.1 CCK-8检测 取第3、6、9、12、15 代的细胞以每孔10 000个细胞接种于96孔板中，待其贴壁加入CCK-8工作液(10 μl/well)，37℃孵育2 h，酶标仪450 nm波长测定OD值来分析细胞活性。

1.6.2 β-半乳糖苷酶染色检测耳蜗血管纹毛细血管内皮细胞衰老程度 用0.25%胰酶消化各组细胞，以5×103cells/well的密度接种于12孔板中，待其贴壁后，弃去培养基，每孔加入0.5 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，固定15 min，PBS洗涤3次，每次3 min，每孔加入0.5 ml染色液，37℃无CO2温箱中过夜孵育，普通光学显微镜下观察，通过对阳性蓝染的细胞计数来判定衰老程度。

1.7 实验分组

选取第3代细胞(P3)为年轻组，第12代细胞(P12)为衰老组，其中衰老组再分为DMSO溶剂组及T16Ainh-A01组(给予TMEM16A特异性阻断剂30 μmol/L T16Ainh-A01干预24 h)。

1.8 流式细胞术检测耳蜗血管纹毛细血管ECs凋亡率

0.25%胰酶消化收集各组细胞, PBS洗涤2次, 1 000 r/min离心5 min, 弃上清收集5×105cells, 加500 μl 1×结合缓冲液重悬细胞;加入5 μl Annexin V-FITC混匀并室温避光反应30 min, 加入10 μl PI混匀并室温避光反应10 min，在1 h内进行流式细胞仪检测。

1.9 免疫荧光检测ECs上TMEM16A表达情况

从CO2培养箱取出处理后的细胞, 弃掉培养基;预温的PBS洗3次, 4%多聚甲醛固定细胞10 min, PBS洗3次; 0.5%BSA 37℃恒温封闭30 min, 弃封闭液, PBS洗3次；兔抗TMEM16A抗体(1∶100), 置于湿盒内4℃过夜；按1∶50比例暗室中滴加FITC标记的山羊抗兔IgG二抗, 37℃恒温孵育2 h；DAPI染核15 min，PBS洗3次，抗荧光衰减封片剂封片, 激光共聚焦显微镜下观察并采像。图像采集后使用Image J 2×软件进行分析。

1.10 Western blot检测蛋白表达水平

弃掉处理后的各组细胞的培养基，用预温的PBS洗3次，每次2 min，加入细胞组织裂解液，将培养皿放置于冰上裂解20 min。细胞刮刀均匀刮落贴壁细胞并收集与EP管中，4℃，12 000 r/min离心15 min，采用BCA法测定蛋白浓度，加上样缓冲液配平，100℃10 min, 蛋白保存在-20℃。SDS-PAGE分离后，转印到0.45 μm或0.22 μm的PVDF膜上，封闭液中室温封闭2 h。分别孵育兔抗TMEM16A抗体 (1∶1 000) 、兔抗Bcl-2抗体 (1∶1 000)、兔抗Bax抗体 (1∶1 000)、兔抗casepase-3抗体 (1∶1 000)、小鼠抗β-actin抗体 (1∶1 000)，4℃过夜，TBST洗膜，分别孵育辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (1∶5 000)或抗小鼠IgG (1∶25 000)，室温摇床孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，用化学发光仪曝光，拍照。

1.11 统计学处理

2 结果

2.1 豚鼠耳蜗血管纹毛细血管ECs的培养及鉴定

豚鼠耳蜗血管纹毛细血管ECs培养48 h，细胞沿血管纹组织块边缘爬出(图1A①)，培养12 d，细胞大量增殖(图1A②)；培养20 d细胞呈紧密排列，融合成片状单层，镜下呈典型的铺路石样外观 (图1A③)。用免疫荧光检测内皮细胞特异性蛋白Ⅷ因子相关抗原(von Willebrand Factor, vWF)的表达，95%以上的细胞核及胞质呈红色荧光着色(图1B，图1见彩图页Ⅰ)。

2.2 耳蜗血管纹毛细血管ECs细胞活力及衰老程度的测定

原代培养的耳蜗血管纹毛细血管ECs通过复制性传代建立衰老模型。如表1所示，利用CCK-8试剂盒检测细胞活性，结果显示与第3代(P3)相比，第12代(P12)ECs细胞活性无明显变化且无统计学差异，而第15代(P15)ECs细胞活性显著降低 (P<0.01)；如图2所示，β-半乳糖苷酶染色显示，与第3代(P3)相比，第6代(P6)、第9代(P9)及第12代(P12)阳性蓝染的细胞逐渐增多(P<0.01)，第15代(P15)衰老细胞光镜下观察细胞形态变大，胞浆中可见空泡及颗粒物，边界不清且立体感弱。故后续实验衰老组选取第12代细胞。

Fig. 2 SA-β-gal staining of cochlear endothelial cells in different passage number (×200)

Tab. 1 Activity of cells in each group was detected by CCK-8 assay and β-galactosidase activity in each group was detected by SA-β-gal staining (%， n=3)

2.3 衰老耳蜗血管纹毛细血管ECs上TMEM16A表达变化

免疫荧光显示，TMEM16A表达于原代培养的耳蜗毛细血管ECs且主要表达于胞质，衰老组(P12)ECs上TMEM16A荧光强度(1.88±0.24)较年轻组(P3)(1.00±0.12)明显增强(P<0.01)。Western blot结果显示，衰老组(P12)ECs上TMEM16A蛋白表达(1.21±0.10)较年轻组(P3)(0.93±0.04)增强(P<0.05，图3，见彩图页Ⅰ)。

2.4 TMEM16A特异性阻断剂T16Ainh-A01对耳蜗血管纹毛细血管ECs凋亡的影响

2.4.1 T16Ainh-A01对凋亡率的影响 如表2所示，Annexin V-FITC/PI双染色结果显示，与衰老组(P12)ECs相比，给予30 μmol/L T16Ainh-A01干预24 h后，细胞早期凋亡率下降(P<0.05)，晚期凋亡率明显下降(P<0.01)。

Tab. 2 The apoptosis rate of cochlear endothelial cells in each group detected by flow cytometry n=3)

2.4.2 T16Ainh-A01对凋亡蛋白表达的影响 如图4所示，Western blot结果显示，与衰老组(P12)ECs相比，给予T16Ainh-A01干预后ECs凋亡蛋白Bax、cleaved casepase-3的表达明显下降(P<0.01), Bcl-2的蛋白表达增加(P<0.05)。

2.5 TMEM16A特异性阻断剂T16Ainh-A01对耳蜗血管纹毛细血管ECs衰老的影响

如图5所示，SA-β-gal染色结果显示，与衰老组(P12)ECs相比，给予T16Ainh-A01干预后耳蜗血管纹毛细血管ECs蓝染率明显降低(P<0.01)。

Fig. 4 Immunoblotting bands of cleaved casepase-3, Bax, Bcl-2 protein(n=3)

Tab. 3 The expressions of cleaved casepase-3, Bax, Bcl-2 protein in each n=3)

Fig. 5 SA-β-gal staining of cochlear endothelial cells n=3)

3 讨论

血管纹性老年聋(stria vascularis hearing loss，SVHL)是老年性耳聋的重要组成部分，以血管纹萎缩为主要特征[5]。耳蜗血管纹内皮细胞(ECs)作为血迷路屏障(blood-labyrinth barrier, BLB)的重要组成，对维持耳蜗内电位稳态及调节BLB通透性具有重要意义[3, 4]。目前对血管纹毛细血管ECs的研究主要集中于形态学改变[6]，对其机制及调控方面研究甚少。血管ECs衰老主要通过端粒依赖性复制性衰老和应激诱发的早衰两种机制,前者随培养增殖，细胞分裂能力减退、消失甚至凋亡；后者是由H2O2、氧化酶等药物制造细胞氧化损伤的非生理性的衰老[7, 8]。我们采用连续传代模型更自然模拟ECs衰老过程，选取第12代细胞作为衰老组进行后续研究。

TMEM16A作为钙激活氯通道(calcium-activated chloride channels, CaCCs)主要组成蛋白，在许多生物活动中都发挥重要作用[9]。在耳蜗中已有研究表明TMEM16A存在于分离的耳蜗边缘细胞[10]和分离的Corti器汉森细胞(Hensen cell)上[11]，参与调节耳蜗内淋巴容积、Cl-的转运及分泌[12]。本课题组前期研究发现豚鼠耳蜗血管纹也表达TMEM16A[2]，本实验研究发现，耳蜗血管纹毛细血管ECs表达TMEM16A，但TMEM16A在耳蜗血管纹毛细血管ECs的功能意义尚不清楚。

TMEM16A表达及功能因表达部位不同而存在差异，早期研究TMEM16A在肿瘤增殖[13]、肺动脉平滑肌细胞增殖[14]及调节血管张力[15]上发挥重要作用。近期有学者发现上调TMEM16A可以诱导肺内皮细胞凋亡[16]，TMEM16A过表达可通过线粒体途径促进脑基底平滑肌细胞凋亡[17]，这说明TMEM16A与细胞凋亡密切相关。另有文献报道，激活TMEM16A可导致细胞内大量Cl-外流，细胞膜去极化，同时Ca2+从内质网中释放到细胞质中，Ca2+浓度升高又可激活CaCCs，细胞内大量的Ca2+可导致细胞的衰老或死亡[18]，提示TMEM16A的激活可以间接导致细胞的衰老。老年性耳聋可引起耳蜗细胞变性、细胞自噬及凋亡增加[19]，TMEM16A与细胞凋亡和衰老密切相关，但TMEM16A是否在耳蜗中调节ECs凋亡及衰老目前尚不清楚。本研究发现，衰老组ECs上TMEM16A蛋白表达水平较年轻组明显升高，给予TMEM16A特异性阻断剂T16Ainh-01后，衰老组ECs凋亡率明显下降，凋亡蛋白Bax、cleaved casepase-3的表达明显减少，同时还能降低细胞SA-β-gal衰老细胞蓝染率，提示TMEM16A可能参与耳蜗血管纹ECs的凋亡及衰老过程。

细胞凋亡是生物进化过程中普遍存在的细胞死亡方式，研究表明年龄相关性听力功能衰退时耳蜗中细胞发生凋亡，这是导致听力下降的重要原因[20]，耳蜗中细胞凋亡率间接反应老年人听力衰退程度。本研究结果显示衰老组细胞凋亡率增高，给予TMEM16A特异性阻断剂T16Ainh-01后衰老组ECs的凋亡率明显降低，减少ECs的凋亡，可以促进内皮细胞的增殖及损伤修复，从而改变衰老引起的耳蜗缺血缺氧损伤。由此推断，T16Ainh-01可能通过抑制衰老耳蜗血管纹毛细血管ECs凋亡，起到延缓听力减退的效果。

综上所述，TMEM16A可能作为耳蜗血管纹毛细血管ECs凋亡的调节分子，通过促进ECs的凋亡进而影响耳蜗血管纹衰老过程，但具体机制仍有待研究。