叶片衰老抑制基因 PSAG12-IPT在小麦遗传改良中的应用

戴 双，郭 军，程敦公，曹新有，巨 伟，訾 妍，吉万全，宋健民

(1.山东省农业科学院作物研究所/小麦玉米国家工程实验室/农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室, 山东济南 250100；2.山东省农作物种质资源中心, 山东济南 250100；3.西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100)

叶片衰老不仅是一个细胞程序化死亡的过程，也是营养成分再利用的过程，如N元素由衰老叶片转移到新生叶片以及叶片中的养分向籽粒中的转移[1-3]。叶片衰老受激素调控，如脱落酸、乙烯和茉莉酸可促进叶片的衰老，而细胞分裂素(CTK)则直接参与衰老相关的过程[4]，包括叶绿素的降解过程和光合作用相关酶的降解过程(如Rubisco酶的降解)。Simmonds等[5]研究表明，延缓小麦旗叶衰老可以提高作物产量。因此，延缓叶片衰老对于培育高产新品种具有重要意义。

PSAG12(promoter of senescence-associated genes)是从拟南芥中分离到的衰老特异性启动子，IPT(isopentenyl transferase gene)是从根瘤农杆菌中分离到的异戊烯转移酶基因，是CTK合成的限速酶[6]。1995年，研究人员首次将PSAG12和IPT构建到同一个表达载体上，并获得携带PSAG12-IPT的转基因烟草，结果发现，与非转基因烟草相比，携带表达载体PSAG12-IPT的转基因烟草叶片持绿时间更长，衰老速度变慢[6]。其作用原理为：当叶片开始衰老时，SAG12被特异激活，促进IPT基因表达，CTK含量增加，使叶片衰老延缓；而叶片衰老延缓反过来又使SAG12启动子关闭，从而避免CTK的过量合成造成植物形态和发育的异常。之后，研究人员将同时携带PSAG12和IPT的表达载体转化到其他植物中，如小麦、油菜、拟南芥、匍匐剪股颖、棉花、玉米、花生和多年生草，获得了一系列转基因株系，发现PSAG12和IPT的共表达载体与植物抗旱性、耐涝性、耐盐性、衰老速度、光合作用和氮素分配等密切相关[6-14]。然而关于PSAG12-IPT基因是否延缓普通小麦衰老的研究较少。

本研究利用共表达PSAG12和IPT的转基因小麦材料TIPT-XN1376与推广小麦品种陕麦159、周麦18、远丰175、西农979和郑麦9023进行杂交，获得F1，自交获得F2，并对其进行分子标记辅助选择和叶绿素含量测定，研究PSAG12-IPT基因在小麦中的遗传特点及其与衰老和叶片叶绿素含量的关系，以期为PSAG12-IPT基因在小麦育种中的利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

携带PSAG12和IPT表达载体的转基因小麦TIPT-XN1376(受体亲本为西农1376)由西北农林科技大学提供,推广小麦品种陕麦159、周麦18、远丰175、西农979和郑麦9023由山东省农业科学院作物研究所小麦育种室提供。以转基因小麦材料为母本，分别与5个推广小麦品种进行杂交获得F1，自交获得F2群体。

1.2 叶片衰老抑制基因 PSAG12-IPT的PCR检测

利用CTAB法提取供试小麦幼嫩叶片的基因组DNA[15]。PCR 引物序列为:PSAG12-F:5′-GCAAAGAGACGGGAAGAAA-3′，PSAG12-R:5′-TGGCTGAAGTGATAACCGTC-3′[7]。

PCR扩增体系为10 μL，包括5 μL 2×Taq master(2×Taq PCR Buffer, 3 mmol·L-1MgCl2，400 μmol·L-1dNTP mix)，DNA模板(100 ng·μL-1)1 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，灭菌双蒸水2 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存。利用2%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE)检测PCR产物[16]。

1.3 叶绿素含量的测定

从上述杂交组合F2群体中，每个组合随机选择30株，参考Arnon[17]、薛 香等[18]的方法测定旗叶叶绿素含量，并做少许改动。具体步骤为：于小麦抽穗期剪取小麦旗叶，立即放入液氮中保存；称取0.2 g待测叶片，剪碎后放入 50 mL量杯中，加入20 mL酒精，封口，并在黑暗中放置 24 h，中间震荡数次，至叶片完全变白；在665和649 nm下测定提取液吸光度，分别用OD665和OD649表示，并计算叶绿素含量。叶片中叶绿素含量的计算公式：CFL=6.63×OD665+18.08×OD649；叶片中叶绿素的相对含量计算公式：

C=CFL/FW×100%，FW为样品鲜重。

1.4 统计分析和图片处理

采用卡方(χ2)法检验F2群体中携带PSAG12-IPT基因植株与不携带PSAG12-IPT基因植株的分离情况。利用SPSS 10.0软件对旗叶叶绿素含量进行差异显著性分析，差异显著性用LSD法来表示；利用Sigmaplot 12.0软件绘制柱形图，并利用PhotoShop CS 6.0软件处理图片。

2 结果与分析

2.1 转基因株系 PSAG12-IPT的PCR检测结果及其遗传特点

每个组合分别提取F1代植株的幼嫩叶片(10株)，从其PCR检测结果(图1)发现，这50个株系均能扩增出526 bp的目标片段，说明F1单株均携带PSAG12-IPT基因。从每个组合的F2代群体中，随机选取30株，对PSAG12-IPT基因进行PCR检测，结果5个组合中携带PSAG12-IPT的植株与不携带PSAG12-IPT植株的比例分别为 22∶8、24∶6、21∶9、20∶10和23∶7(表1)。卡方测验表明，PSAG12-IPT以单基因的形式在子代中稳定遗传。

M：DL2000；ZH1：组合1-F1；ZH2：组合2-F1；ZH3：组合3-F1；ZH4：组合4-F1；ZH5：组合5-F1；T1376：TIPT-XN1376；1：西农1376；2：陕麦159；3：周麦18；4：远丰175；5：西农979；6：郑麦9023。

表1 PSAG12-IPT在F2群体中的遗传分析

2.2 转基因材料后代的叶片叶绿素含量

由图2可知，携带PSAG12-IPT的株系旗叶叶绿素含量比其父本以及不携带PSAG12-IPT的株系均有显著提高。与亲本西农1376相比，转基因株系TIPT-XN1376的叶绿素含量增加了9.1%；组合1-F2群体中携带PSAG12-IPT的株系旗叶叶绿素含量比不携带PSAG12-IPT的株系增加了 6.0%；组合2-F2群体中携带PSAG12-IPT的株系旗叶叶绿素含量比不携带PSAG12-IPT的株系增加了10.5%；组合3-F2群体中携带PSAG12-IPT的株系旗叶叶绿素含量比不携带PSAG12-IPT的株系增加了4.2%；组合4-F2群体中携带PSAG12-IPT的株系旗叶叶绿素含量比不携带PSAG12-IPT的株系增加了9.9%；组合5-F2群体中携带PSAG12-IPT的株系旗叶叶绿素含量比不携带PSAG12-IPT的株系增加了5.4%。

1：TIPT-XN1376；2：西农1376；3：组合1-F2群体中携带 PSAG12-IPT的株系；4：组合1-F2群体中不携带 PSAG12-IPT的株系；5：陕麦159；6：组合2-F2群体中携带 PSAG12-IPT的株系；7：组合2-F2群体中不携带 PSAG12-IPT的株系；8：周麦18；9：组合3-F2群体中携带 PSAG12-IPT的株系；10：组合3-F2群体中不携带 PSAG12-IPT的株系；11：远丰175；12：组合4-F2群体中携带 PSAG12-IPT的株系；13：组合4-F2群体中不携带 PSAG12-IPT的株系；14：西农979；15：组合5-F2群体中携带 PSAG12-IPT的株系；16：组合5-F2群体中不携带 PSAG12-IPT的株系；17：郑麦9023。误差线表示重复间的误差,图柱上不同字母表示品系间差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

植物的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关[1-3]。不论是控制质量性状的基因还是控制数量性状的基因，基因在子代的传递过程都遵循孟德尔遗传规律[19-21]。然而，关于转基因株系中被转入基因遗传特点的研究还未见报道。本研究以转基因株系TIPT-XN1376与普通小麦品种陕麦159、周麦18、远丰175、西农979和郑麦9023杂交获得的F2群体为试验材料，利用PSAG12-IPT基因的特异分子标记[7]进行PCR检测，结果表明，150个后代中，转基因株系中携带PSAG12-IPT植株与不携带PSAG12-IPT植株的数目比例为110∶40，χ2检验结果表明，符合3∶1的遗传特点，即转基因株系TIPT-XN1376中PSAG12-IPT基因是以单拷贝的形式存在的，并且其遗传符合孟德尔单基因遗传规律。

目前，已将PSAG12和IPT共表达载体转入多种植物，发现转基因植株抗逆性明显增强、衰老速度延缓，光合作用、氮素分配也发生明显改变[6-14]。然而关于PSAG12-IPT基因延缓普通小麦衰老的研究较少。本研究测定了转基因株系、受体亲本及其转育后代旗叶的叶绿素含量，结果发现，5个组合F2群体中携带PSAG12-IPT的株系中旗叶叶绿素含量(平均55.4 mg·g-1)均比不携带PSAG12-IPT的株系(平均51.7 mg·g-1)显著提高，平均提高7.2%，说明PSAG12-IPT基因能够降低植株叶片叶绿素降解速率，使叶片维持较长的持绿时间。然而，尽管PSAG12-IPT嵌合基因在叶片衰老时表达，从本研究初步测定结果看，转基因后代叶片叶绿素含量也表现明显升高的趋势，这对于植株整体形态保持和提高生物学产量是非常有利的，但是这种生理上的变化与转入基因的关系有待进一步确认和研究。