基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的茶叶育种研究

陈润仪

（黑龙江大学，黑龙江哈尔滨150000）

我国作为茶叶大国，对于茶叶具有很高的需求量，尽管我国拥有的茶园面积在世界中排名前列，但真正能够培育出优质茶叶的茶园不多。因此，在市场中经常会出现优质茶叶供不应求的现象，导致优质茶叶的价格一升再升[1]。为能够培育出更多优质的茶叶，茶叶育种是实现这一目标的有效途径。随着我国农业现代化的步伐不断加快，必须充分认识到生物科学技术为茶叶育种带来的新机遇与新挑战。我国针对茶叶育种的研究起步较晚，且未结合先进的技术作为支持，导致在实际茶叶育种过程中存在茶叶育种成活率低的现象。因此，对于茶叶育种方法的优化设计是具有现实意义的，有理由以提高茶叶育种成活率作为茶叶育种方法优化设计分主流方向。CRISPR-Cas9 基因编辑技术作为一种基因治疗技术，能够基因角度出发，通过DNA 剪接的技术，进而达到治疗的目的[2]。基于此，有理由将CRISPRCas9 基因编辑技术应用在茶叶育种中，本文通过基于CRISPRCas9 基因编辑技术设计一种新型茶叶育种方法，致力于从根本上提高茶叶育种的成活率，为栽培出更多优质的茶叶提供方法支持。

1 CRISPR-Cas9基因编辑技术

CRISPR-Cas9 基因编辑技术最早是由EditasMedicine 公式研发而来的，该项技术最初研发的目的是为了治疗肺癌所诞生的，并且取得了一定的成果。随着该基因编辑技术的不断完善发展，被广泛应用到由于基因遗传所导致的疾病中，通过剪接DNA 的方式，起到治疗效果[3]。CRISPR-Cas9 基因编辑技术治疗的核心理念就是通过长期的干扰，使细菌能够形成适应性免疫防御，进而抵抗外来病毒的入侵。由此可见，该基因编辑技术能够通过转基因的方式，将基因敲除，通过染色体重组的方式加以代替。

CRISPR-Cas9 基因编辑技术在不断的设计改进中，能够适应更多更为广泛的领域。CRISPR-Cas9 基因编辑技术在植物领域中的应用已经不是首次提出，早于2016 年就有学者该基因编辑技术应用在水稻育种中，并且能够提高水稻育种的存活率。CRISPR-Cas9 基因编辑技术相比于普通基因编辑技术在植物领域中应用最明显的优势在于，CRISPR-Cas9 基因编辑技术能够实现多位点基因顶点敲除，而普通基因编辑技术只能进行单位点基因顶点敲除。且CRISPR-Cas9 基因编辑技术在遗传方面相比于普通基因编辑技术稳定性更高，能够精准控制外源基因插入位点，具备外源基因可分离的特性。本文认为CRISPR-Cas9基因编辑技术在水稻育种中的应用与茶叶育种具有一定的相似性。因此，基于CRISPR-Cas9 基因编辑技术的茶叶育种方法，具体设计内容，如下文所述。

2 基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的茶叶育种方法

本文基于CRISPR-Cas9 基因编辑技术中的DNA 剪接方式，优化设计茶叶育种方法。其核心思想在于通过敲除茶叶育种致死基因，敲入茶叶育种优质基因的方式，实现实现茶叶优质育种。针对本文设计的基于CRISPR-Cas9 基因编辑技术的茶叶育种方法具体研究内容，详见下文。

2.1 CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除茶叶育种致死基因

在茶叶育种过程中，必然会存在很多因素，制约茶叶育种的存活率，主要包括：BEL 以及启动子sgR-NA，可以将其统称为茶叶育种的致死基因[4]。为提高茶叶育种的存活率，本文基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过DNA剪接的方式，敲除茶叶育种致死基因。其具体流程为，首先，可以选取一个茶叶育种样本，通过构建载体，用于表达茶叶的愈伤组织，观察其在育种过程中是否存在缺失突变。而后，一旦发现在育种过程中，存在缺失突变就可以运用CRISPR-Cas9 基因编辑技术中的E-CRISPRTest 工具，进行多位点基因顶点敲除。在此过程中，针对同一种类的茶叶育种致死基因可以进行多位点基因顶点敲除，针对不同种类的茶叶育种致死基因也可以运用CRISPR-Cas9 基因编辑技术中的E-CRISPR工具，进行单位点基因顶点敲除[5]。最后，在确保茶叶育种中致死基因被完全敲除的前提下，为下文敲入茶叶育种优质基因奠定良好的基础。

2.2 CRISPR-Cas9基因编辑技术敲入茶叶育种优质基因

在基于CRISPR-Cas9 基因编辑技术敲除茶叶育种致死基因的基础上，本文通过敲入茶叶育种优质基因的方式，进一步提高茶叶育种的成活率[6]。首先，运用CRISPR-Cas9 基因编辑技术，将sgRNA：pcoCas9茶叶育种优质基因导入茶叶树苗。再通过酶切位点的628bp为茶叶育种提供同源序列供体，敲入茶叶育种优质基因，并将其作为茶叶育种的外源基因。在此基础上，还需要在茶叶育种中的ADHI位点插入抗性编码基因，使其能够形成适应性免疫防御。最后，运用CRISPR-Cas9 基因编辑技术中的CRISPR-Direct 工具，精确控制外源基因插入位点，保证茶叶育种优质基因敲入的过程为稳定遗传的过程。

2.3 实现茶叶育种

通过CRISPR-Cas9 基因编辑技术敲入茶叶育种优质基因，实现高质量的茶叶育种[7]。在此过程中，必须注意的是基于CRISPR-Cas9 基因编辑技术敲入的茶叶育种优质基因，在本质上具备可分离的特点，也就是说能够实现非末端同源连接。因此，可以针对不同茶叶品种，选择与其匹配度最高的优质基因作为外源基因敲入。与此同时，也可以应用该基因编辑技术尝试培育新树种，在原有茶叶树种的基础上加以升级，进一步提高茶叶育种的成活率。以此，实现基于CRISPR-Cas9 基因编辑技术的茶叶育种。

3 实例分析

3.1 实验准备

本次实验选择某茶叶树种作为实验对象，实例分析内容为测试茶叶育种的成活率。本文共选取同一种类的茶叶树苗1000株，分为实验组与对照组，每组各500 株。针对实验组的茶叶育种采用CRISPR-Cas9 基因编辑技术，针对对照组的茶叶育种采用普通育种方式。通过该计算实验组与对照组的茶叶育种成活率，判断两种茶叶育种方法在现实应用中的可行性。设茶叶育种成活率的计算表达式为p，则有公式（1）。

公式（3）中，e 指的是茶叶育种成活数量，单位为株；U 指的是茶叶育种总数，在本次实验中每组设定为500 株。通过公式（1），计算出实验组与对照组的茶叶育种成活率。在此次的实验中，以每100 株茶叶树种为一个记录节点，通过同组茶叶育种成活率相加求平均值的方式，求得其整组的茶叶育种成活率，记录实验结果。

3.2 实验结果分析与结论

将计算后得出的茶叶育种成活率汇总，整理实验结果，如表1所示。

表1 茶叶育种成活率对比表

通过表1可得出如下的结论：本文设计方法茶叶育种成活率明显高于对照组，体现出设计方法在实际应用中的价值，证明其值得被大力推广。

4 结束语

本文通过实例分析的方式，证明了设计茶叶育种方法在实际应用中的适用性，以此为依据，证明此次基于CRISPR-Cas9 基因编辑技术优化设计的必要性。因此，有理由相信通过本文设计，能够解决传统茶叶育种中存在的缺陷。但本文同样存在不足之处，主要表现为未对本次茶叶育种成活率测定结果的精密度与准确度进行检验，进一步提高茶叶育种成活率测定结果的可信度。这一点，在未来针对此方面的研究中可以加以补足。与此同时，还需要对茶叶育种方法的优化设计提出深入研究，以此为提高茶叶育种质量提供建议。