益生菌生态调节在牙周病防治中的应用

刘琳 周婕妤 吴亚菲 赵蕾

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙周病科 成都 610041

牙周病是一组发生在牙周支持组织的疾病，其始动因素是菌斑生物膜。牙菌斑生物膜致病的学说包括非特异性菌斑学说、特异性菌斑学说，而生态菌斑学说即微生态失调对牙周病的发病机制进行了进一步的补充，为牙周病的治疗提供了新思路[1]。

目前，牙周病的经典治疗方法仍是机械方式去除菌斑[2]，然而龈下菌斑生物膜微生物组成复杂，局部微生境结构多变，机械治疗不能彻底清除患处的菌斑细菌，且治疗后位点往往会发生牙周致病菌的再定植[3]；辅助使用全身或局部抗菌类药物虽可提高临床疗效，但存在耐药性问题，且会降低口腔共栖菌对致病菌的定植抗力，扰乱正常的口腔微生物群落[4]。近年来还出现激光及光动力等辅助治疗方法[3]，但目前的治疗手段仍无法达到重塑有益牙周微生态的目的。

益生菌（probiotics）指“当在宿主体内运用到足够量时，对宿主健康有益的活体微生物”[5]。目前已投入临床应用的益生菌主要分为3类：乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobac-terium）和链球菌属（Streptococcus）。益生菌具有重建宿主微生物群落、调节免疫炎症反应等改善宿主微生态的作用[6]，已广泛应用于胃肠道疾病的治疗[7]。口腔与胃肠道相通，同样存在复杂的微生态。近年来，益生菌在牙周炎、牙龈炎、口腔异味、种植体周围疾病等方面的应用越来越引起关注，本文就相关内容进行综述。

1 益生菌在牙周病防治中的应用研究

1.1 牙周炎

牙周炎是一种以附着丧失、牙周袋形成、牙槽骨吸收为临床表现的牙周疾病，包括慢性牙周炎和侵袭性牙周炎。目前应用于牙周炎防治研究的益生菌主要为乳杆菌属，其对患者的临床、微生物及免疫指标均存在益生效应。

1.1.1 牙周临床指标 路氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）是应用于牙周炎辅助治疗中研究最多的益生菌。多数研究显示，路氏乳杆菌辅助洁刮治及根面平整（scaling and root planning，SRP）治疗牙周炎可显著改善临床指标。

Tekce等[8]对40名慢性牙周炎患者进行口腔卫生宣教及全口SRP后，分别给予路氏乳杆菌含片或安慰剂（3周），在基线以及21、90、180、360 d检测其菌斑指数（plaque index）、牙龈指数（gingival index）、探诊出血（bleeding on probing）、探诊深度（probing depth）及临床附着水平（clinical attachment level）后发现：试验组菌斑指数、牙龈指数、探诊出血、探诊深度相对于对照组均有显著改善，90 d后试验组临床附着水平改善优于对照组；试验组牙周炎进展风险更低，需要手术的患者数及牙位点数更少。另有一部分研究[9-11]结果也提示益生菌辅助SRP具有积极性影响。

一些研究结果并不支持路氏乳杆菌的额外效应。Teughels等[12]的研究显示，SRP后接受12周路氏乳杆菌治疗与对照组相比，仅在少数时间点表现出菌斑指数和牙龈指数的组间差异，探诊深度、临床附着水平值则无明显改善，样本量少可能是结果呈阴性的原因。Penala等[13]也未发现路氏乳杆菌能改善总体临床指标，分析可能是由于患者基线情况较好或益生菌使用时间较短。虽然上述2项研究在总体指标的改善上无组间差异，有趣的是，当进行分层比较时，Teughels等[12]发现，当基线水平为中、深度牙周袋（即探诊深度分别为4～6 mm、≥7 mm）时，试验组探诊深度、临床附着水平指标改善优于对照组；Penala等[13]也发现，对于中度牙周袋（探诊深度4～6 mm）的患者，使用路氏乳杆菌可改善探诊深度，与对照组存在差异。

2项Meta分析[14-15]显示，使用益生菌组的临床附着水平获得量更多，益生菌对于中、深度牙周袋探诊深度改善更具有优越性。

Morales等[16-17]将鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）作为辅助治疗的益生菌。在2016年发表的临床随机对照研究（randomized controlled clinical trial）[16]中，对慢性牙周炎患者SRP后辅助口服鼠李糖乳杆菌SP1冲剂3个月，发现尽管各时间点试验组探诊出血、菌斑指数、探诊深度、临床附着水平等指标的改善情况无显著优势，但随访1年时可见试验组探诊深度≥6 mm的患者数量相对基线值显著减少，手术需求减少，而对照组无此变化，提示鼠李糖乳杆菌SP1可能具有降低患者疾病进展风险的作用。该课题组[17]随后比较了口服鼠李糖乳杆菌SP1冲剂或阿奇霉素组的临床指标变化，结果显示益生菌组、阿奇霉素组与仅SRP组的临床疗效类似，3组之间无差异。

Invernici等[18]首次研究双歧杆菌属辅助SRP治疗的效果，发现乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）组（乳双歧杆菌HN019含片，使用30 d）在30和90 d时探诊深度、临床附着水平、探诊出血改善均优于对照组，90 d时深度牙周袋（探诊深度≥7 mm）探诊深度和临床附着水平的改善与单独使用甲硝唑或甲硝唑联合阿莫西林辅助SRP的临床研究结果类似；此外，该研究还显示了90 d时乳双歧杆菌在中、深度牙周袋上临床附着水平获得和探诊深度减少的优势，益生菌组初始深度牙周袋（探诊深度≥7 mm）的位点转归成浅度牙周袋（探诊深度≤3 mm）的比例较对照组高36%，表明需要手术治疗的患者、患牙及位点数减少，疾病进展风险降低，这与前述使用路氏乳杆菌及鼠李糖乳杆菌SP1的某些研究[8,10,12-13,16]所获得的结果一致。

1.1.2 微生物学及免疫学指标 多数研究显示，益生菌辅助SRP治疗在短期内可改善牙周炎患者龈下微生态。

Penala等[13]在SRP后辅助使用含路氏乳杆菌和唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）的漱口水15 d，并在龈下滴入益生菌液4次，在SRP后1个月，接受辅助治疗组龈下红色复合体数量少于对照组，但3个月时有所回升且组间差异消失。Tekce等[8]使用路氏乳杆菌辅助SRP，结果发现龈下总菌落和专性厌氧菌数量变化趋势与Penala等[13]的研究结果类似。

有研究[12]利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）技术检测了特定牙周致病菌数量，发现SRP后应用路氏乳杆菌12周时，试验组牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）与中间普雷沃氏菌（Prevotella intermedia）数量明显下降，且牙龈卟啉单胞菌下降更为明显。Vivekananda等[11]发现单独应用路氏乳杆菌21 d或与SRP联合组均可观察到牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、中间普雷沃氏菌数量明显下降，但与仅行SRP组牙周致病菌数量改变的差异无统计学意义。相关研究[18]除发现牙周致病菌数量减少外，还表明给予乳双歧杆菌60 d后，内氏放线菌（Actinomyces naeslundii）、缓症链球菌（Streptococcus mitis）比例较高，红色复合体比例下降，提示益生菌治疗短期内可提高有益共生菌比例，延缓牙周致病菌的再定植。

一些研究[9-10,18]分析了龈沟液中免疫学指标的变化，结果显示：路氏乳杆菌和乳双歧杆菌对包括肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-8、IL-10、IL-17等细胞因子以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族的成员MMP-8和基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）-1的分泌水平有影响，益生菌试验组的炎症介质改善情况优于对照组。

综上可见，益生菌辅助SRP在短期内似乎有益。益生菌对中、深度牙周袋临床改善更有利，可降低牙周炎疾病进展风险，这可能因为中、深度牙周袋龈下微生物群落与浅度牙周袋之间存在差异[19]。另外，由于益生菌菌株特异性、纳入对象参差不齐、SRP治疗效果等差异，加上随访时间普遍较短，尚需更多高标准、高质量的临床随机对照研究证据。

1.2 牙龈炎

本文提及的牙龈炎仅指菌斑性牙龈炎。菌斑性牙龈炎是一种由牙菌斑生物膜积聚而引起的位点特异性疾病，以牙龈红肿、无牙周附着丧失为特征。Iniesta等[20]对系统性健康的牙龈炎患者仅牙面抛光后分组给予路氏乳杆菌或安慰剂含片28 d，4周和8周时皆未发现菌斑指数、牙龈指数的组间差异，牙龈炎症程度相似。Sabatini等[21]纳入了80例罹患2型糖尿病的牙龈炎患者，仅进行口腔卫生宣教后随机分组再给予路氏乳杆菌或安慰剂含片（30 d），30 d时发现试验组菌斑指数（12%±3%）和探诊出血（15%±2%）改善显著优于对照组（26%±4%，33%±7%）。上述2项研究结果存在差异，可能由于纳入研究对象不同，患有糖尿病的牙龈炎患者感染程度相对较重，提示益生菌可能对牙龈炎炎症较重位点的改善效果较好，这与下列研究[22-23]结果一致。

有研究[23]使用包含了植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的益生菌含片进行试验，在使用专业机械去除牙菌斑后，试验组使用益生菌6周时高牙龈指数值位点数较对照组显著减少。另有研究[22]显示，专业性预防洁刮治后使用乳双歧杆菌28 d，未观察到临床指标改善，但在停止刷牙5 d后，菌斑指数、牙龈指数、探诊出血改善优于对照组。

牙龈炎可逆且多数炎症较轻[24]，机械治疗反应性好，加上良好的口腔卫生，短期内反映的主要是机械治疗效果，益生菌效应不明显。但炎症较重位点往往龈袋深且龈下微生境复杂，机械治疗效果有局限性[24-25]，这可能是益生菌在炎症较重位点具有优越性之因，与益生菌在中、深度牙周袋效果表现一致。然而，相关研究数量较少，仍需更多实验数据加以佐证。

1.3 口腔异味

口腔异味是指在呼吸时呼出令人不愉快的气味，是牙周炎的伴发病变之一，清除或减少口腔内微生物（特别是牙周致病菌）及其分解产物是改善口腔异味的重要措施。

研究显示，益生菌可减少口腔异味患者的感官评分（organoleptic score）。对仅有主观口腔异味症状的患者给予含或不含路氏乳杆菌的口香糖，14 d后试验组口腔异味症状明显减轻，感官评分改变具有组间差异，但挥发性硫化物改变无差异，提示路氏乳杆菌可能通过抑制不产挥发性硫化物的致病菌来减轻症状[26]。有研究[13]应用含路氏乳杆菌和唾液乳杆菌的漱口水辅助SRP治疗伴口腔异味的慢性牙周炎，发现试验组感官评分明显减少。另有研究[27]对口内存在探诊深度3～6 mm且探诊出血的口腔异味患者给予唾液乳杆菌WB21含片治疗，发现益生菌组挥发性硫化物及甲基硫醇减少量高于对照组，试验期间益生菌组平均探诊深度、菌斑指数、探诊出血、舌苔评分的改善更明显，唾液内细菌总量及具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）数量下降更多，提示唾液乳杆菌WB21可通过抑制产挥发性硫化物致病菌（如具核梭杆菌）发挥改善口腔异味的作用。

口腔异味多源于舌苔和牙周疾病，也有少数为非口源性，消化道疾病及其特征细菌幽门螺杆菌对于口腔异味的影响已得到肯定。有研究猜测，益生菌辅助治疗口腔异味可能同时改善口腔和胃肠道微生物群落，从而提高口腔异味的治疗效果。异味化合物产生涉及多种致病菌，而益生菌的益生效应具有菌种、菌株特异性，未来其在口腔异味上的治疗策略可能趋向个性化及多菌种、菌株益生菌的联合使用。

1.4 种植体周围疾病

根据2017年牙周病学新分类，牙周疾病包括牙周疾病及状况和种植体周围疾病及状况两大部分，其中种植体周围疾病又分为种植体周围黏膜炎和种植体周围炎。

种植体周围黏膜炎和种植体周围炎发病率可分别高达65%和47%，由于种植体与牙周软硬组织结合的特殊性，其治疗效果更难以预测，因此种植体周围疾病关键在于预防[28]。

Flichy-Fernández等[29]针对22名种植体周围健康、12名患种植体周围黏膜炎的研究对象进行药物交叉试验，两组行龈上预防性洁治后1个月，接受含路氏乳杆菌含片（30 d）治疗，再经历6个月洗脱期，后服用30 d安慰剂，结果发现两组在使用益生菌时菌斑指数、出血指数（bleeding index）、探诊深度均得到明显改善（种植体周黏膜炎组出血指数除外），且龈沟液中IL-1β、IL-6、IL-8分泌量及龈沟液体积均显著减少，而安慰剂组未观察到此类变化。

Tada等[30]研究使用抗生素后路氏乳杆菌对种植体周围炎的影响，30名患者接受口腔卫生宣教和龈上洁治后给予阿奇霉素3 d，随后给予路氏乳杆菌含片或安慰剂6个月。在整个试验期间细菌数量的变化未有组间差异，第4周和第24周益生菌组探诊深度明显低于抗生素治疗后1周的检测值，24周时益生菌组出血指数明显低于安慰剂组，且安慰剂组有3位患者探诊出血率明显升高。这提示益生菌可延缓使用阿奇霉素后由于牙周致病菌再定植导致的黏膜炎症加剧现象。

另有研究对益生菌的积极效应产生质疑。在1项纳入59名种植体周黏膜炎患者的临床随机对照研究[31]中，给予患者洁刮治和口腔卫生宣教后，试验组同时接受龈上下局部给予含路氏乳杆菌油剂和口服含片（3个月），随访24周，结果显示2组探诊深度、探诊出血和炎症介质水平在某些检测时间点得到改善，但无组间差异，细菌数量、种类改变与Tada等[30]的微生物结果一致。

上述研究总体反映出益生菌对种植体周围黏膜炎症和免疫指标具有趋向改善性，但未观察到微生物指标变化，提示益生菌似乎通过影响宿主反应而不是改善微生物群落来预防炎症，但还需大量证据论证。值得注意的是，Flichy-Fernández等[29]发现益生菌可以改善健康个体的临床参数，提示其在预防种植体周围疾病方面的应用前景。

2 益生菌的作用机制

益生菌在口腔内的作用机制与在身体其他部位（如胃肠道）的机制既相似，又有其特殊性。对益生菌在口腔疾病中的作用机制的研究仍处于探索阶段，以下从牙周疾病角度进行简单归纳。

2.1 屏障作用[32-33]

1）益生菌通过降低唾液pH，形成不利于致病菌生存的环境。如路氏乳杆菌可以产生乳酸和乙酸。2）中和代谢产物，粪肠球菌WB2000的代谢产物可中和甲基硫醇。3）另一种可能的作用是增强牙龈上皮屏障。

2.2 抑制牙周致病菌[9,32,34-36]

益生菌可通过竞争营养及结合位点排斥牙周致病菌，可产生有机酸、过氧化氢、细菌素及细菌素样抑制物质抑制致病菌。路氏乳杆菌DSM 17938可产生具有抗菌性能的表面活性物质，移除关键性黏附蛋白gp340而抑制致病菌黏附，产生的乳酸可通过细菌细胞膜并改变细胞质，在甘油存在下可产生细菌素引起致病菌的氧化应激作用。路氏乳杆菌ATCC PTA 5289可产生过氧化氢。

2.3 宿主免疫炎症反应的调节[6,32,36-38]

益生菌可调节固有和特异性免疫炎症反应，减少炎症细胞的数量，并与免疫相关细胞（如T细胞、巨噬细胞）相互作用，调节炎症介质，使促炎介质（如IL-1β、IL-6、TNF-α、前列腺素E2等）水平下降，抗炎介质（如IL-10）水平升高。

体外研究表明，路氏乳杆菌ATCC PTA 5289主要通过降低炎症反应（如下调TNF-α水平）发挥作用。路氏乳杆菌ATCC PTA 5289与路氏乳杆菌DSM 17938的混合产品（即ProDentis）在定植的情况下可提高唾液免疫球蛋白A的浓度，还发现其在不影响人成纤维细胞活性的情况下可改善IL-1β刺激下人成纤维细胞的急性炎症反应。

2.4 益生菌定植[20,32,39]

对于益生菌在口腔发挥益生作用是否依赖于定植，仍存在争议。不少研究表明，益生菌的定植仅部分存在，定植时间依赖于益生菌的应用时间；对未检测到益生菌定植的对象，也观察到临床等指标的改善。同时有研究表明，益生菌的定植不是其发挥作用的必要条件，益生菌的保护效应至少部分是其自身DNA介导的，不依赖代谢和定植能力。

3 益生菌临床产品介绍

目前作为临床药物使用的益生菌主要应用在胃肠道方面，应用到口腔的益生菌药物仍很匮乏。ProDentis（BioGaia公司，瑞典）是一种由1×108集落形成单位（colony forming unit，CFU）路氏乳杆菌DSM 17938和1×108CFU路氏乳杆菌ATCC PTA 5289组成的口腔益生菌产品。本文涉及的临床研究多数使用ProDentis，因此以下对其进行简单介绍。

ProDentis包含的2种菌株分别来源于健康妇女的母乳和1位口腔卫生状况不佳但无龋病、无牙周病的健康妇女的唾液。临床应用ProDentis的相关研究[8-11,26,29-31]显示，ProDentis辅助治疗牙周相关疾病，可改善临床指标（如探诊出血、菌斑指数、临床附着水平），改善龈下微生态，使致病菌（如牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌等）减少、共生菌增加，调节宿主免疫炎症反应。然而，也有少数研究[12-13]得出非积极的结果，表明ProDentis辅助治疗牙周炎仅对中、深度牙周袋改善效果显著。2项Meta分析[14-15]支持ProDentis短期内可提高牙周炎患者的临床附着水平。目前，Pro-Dentis已在意大利、日本、中国香港地区等上市，有含片、口香糖或滴剂等形式，可供患者局部或全身使用。

4 结语

针对益生菌在牙周相关疾病中的作用的研究虽已取得一定成果，但现有研究对益生菌菌种及菌株、剂型、浓度、给药时间、研究对象选择与预处理等都没有标准化，目前对其作用机制了解尚不充分，临床产品应用局限。对益生菌安全性问题的研究较少，有研究[40]表明益生菌可能引起全身感染，刺激免疫系统，干扰新陈代谢，参与基因转移。未来益生菌研究应兼顾其临床效应和安全性。