GSNO上调人血管内皮细胞系EA.hy926 PDK1和LDHA mRNA的表达

严洁萍，张丽玉

(1.浙江省人民医院 杭州医学院附属人民医院 药学部， 浙江 杭州 310014；2.浙江大学城市学院 药学院， 浙江 杭州 310015)

S-亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione，GSNO)是机体内源性S-硫醇，具有影响蛋白质活性、稳定性及核质分布的作用，参与血管性疾病发生[1]。

在大鼠心肌缺血损伤模型中，GSNO可通过修饰三重基序蛋白TRIM72减轻缺血引起的心脏损伤和减少梗塞面积。低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)cys533位点经GSNO S-亚硝基化修饰可减少大鼠脑缺血再灌注的继发性损伤[1-2]。体外研究发现GSNO还可诱发线粒体关联的内皮细胞凋亡。目前，GSNO对血管的作用仍有争议，探索其对线粒体关联代谢功能的影响及HIF-1α参与调控的可能分子机制，对血管内皮早期病理生理评估具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂:血管内皮细胞系EA.hy926细胞(ATCC公司)。GSNO和四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Sigma-Aldrich公司)；DMEM培养基和胎牛血清(Gibco公司); PCR相关试剂、引物、乳酸检测试剂盒和核蛋白提取试剂盒(上海生工生物工程产品)；HIF-1α、β-actin、Lamin B抗体及辣根过氧化物酶标记抗体(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：将血管内皮细胞EA.hy926分为：1)对照组及2)GSNO组，加入GSNO 使其总浓度为500 μmol/L。每组设3个复孔。

1.2.2 MTT法检测细胞存活率：细胞与GSNO共培养1、3、6和12 h，检测其细胞存活率。

1.2.3 比色法检测内皮细胞乳酸水平：按测定试剂盒说明书操作。

1.2.4 RT-qPCR检测细胞乳酸脱氢酶A(lactate dehydro-genase A,LDHA)和丙酮酸脱氢酶激酶1(phosphoinositide dependent protein kinase-1,PDK1)mRNA表达：各组细胞样本加入0.5 mL Trizol试剂提供总RNA。用反转录试剂盒反转为cDNA进行扩增。以下为引物序列：LDHA：上游：5′-CAAA GTCCAAGATGGCAACCC-3′，下游：5′-AGCACCAACCCCAA CAACTG-3′；PDK1：上游：5′-TTACGGATTGCCCATATCACG-3′，下游：5′-CCCGGTCACTCATCTTCACAGT-3′；β-actin：上游：5′-ATGGAATCCTGTGGCATCCAT-3′，下游：5′-TCCTGCATC CTGTCAGCAATG-3′。 反应条件：90 ℃变性30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s共35个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt计算各组mRNA相对表达水平。

1.2.5 Western blot检测HIF-1α的核质表达：按试剂盒说明分别提取细胞质和细胞核中蛋白。BCA法检测蛋白浓度，-80 ℃保存。蛋白于沸水中变性10 min，在10% SDS-PAGE中电泳约1 h，用电转膜仪将蛋白转印至PVDF膜上；5% BSA封闭，加入稀释的一抗(HIF-1α，Lamin B和β-actin)，4 ℃过夜；次日加入HRP标记二抗室温孵育1～2 h，采用ECL法检测蛋白表达。采用Image J 5.0软件分析蛋白表达结果。

1.2.6 免疫化学法检测HIF-1α蛋白在细胞核中的荧光表达：细胞经GSNO暴露后弃去上清液，加入-20 ℃甲醇固定15～20 min。10% BSA室温封闭1h，加入HIF-1α一抗(1∶100)4 ℃孵育过夜。次日加入荧光二抗避光孵育2 h，加入DAPI染色1 min后拍照。

2 结果

2.1 GSNO对细胞存活率及内皮细胞乳酸水平的影响:与对照组相比，GSNO组在1～12 h内细胞存活率无明显差异，乳酸水平升高(P<0.01)(表1)。

2.2 GSNO对PDK1和LDHA mRNA水平及HIF-1α蛋白核内积聚的影响:血管内皮细胞暴露GSNO 6和12 h后，LDHA和PDK1的mRNA水平上调(图1A，B)。HIF-1α在细胞核中的表达呈时间依赖性上调(1～12 h)，而在细胞质中无明显表达(图1C，D)。GSNO组中HIF-1α(绿色荧光)与DAPI(蓝色荧光)表达一致(图1E)。

表1 GSNO对EA.hy926细胞存活率及上清液的乳酸水平的影响Table 1 Cell viability and lactic acid level in the supernatant after GSNO treatment in EA.hy926

*P<0.01 compared with control group.

A, B.GSNO increased LDHA and PDK1 mRNA expression; C.HIF-1α protein upregulated in nucleus after GSNO treatment; D.quantification of HIF-1α protein expression was depicted in histogram; E.GSNO promoted HIF-1α protein into cell nucleus; HIF-1α protein (green) and cell nucleus (blue) were located the same plot by immunofluorescence analysis after GSNO treatment; scale bar=50 μm; *P<0.01 compared with control group图1 GSNO对EA.hy926细胞LDHA、PDK1 mRNA水平及HIF-1α蛋白核内积聚及入核活化的影响Fig 1 Effect of LDHA，PDK1 mRNA expression and HIF-1α accumulation in nucleus of EA.hy926 cells

3 讨论

在完整的心肌细胞中，GSNO浓度小于25 mmol/L或大于100 mmol/L均导致生理或病理学变化。GSNOR-/-可易化HIF-1α S-亚硝基化，增加心肌毛细血管，减少急性心肌缺血面积，维持心室收缩和舒张功能[3]。GSNO可上调β-arrestin 2 S-亚硝基化水平，易化β2-adrenergic受体关联信号通路发生，促进周围血管舒张，增加血液流量[4]。本研究发现GSNO促LDHA及PDK1等代谢酶mRNA表达上调，同时伴HIF-1α的稳定持续表达。GSNO处理1h后α亚基在细胞核中表达，可能是由于蛋白翻译后修饰的方式占有降解区域残基，并受GSNO诱导入核活化，提示HIF-1α的核内表达介导了GSNO上调LDHA和PDK1 mRNA水平。

总之，GSNO可通过促HIF-1α核内积聚上调血管内皮细胞PDK1和LDHA mRNA水平，同时伴乳酸水平升高，提示GSNO可能参与调控内皮细胞能量代谢过程。