火麻仁标准汤剂的UPLC指纹图谱

陈锦霞，曾杉，林碧珊，陈伟钢，吕豪辉

国药集团 广东环球制药有限公司，广东 顺德 528303

火麻仁为桑科植物大麻CannabissativaL.的干燥成熟果实[1]，始载于《神农本草经》，列为上品，性平，味甘。其具有润肠通便的作用，多用于血虚津亏、肠燥便秘。近代药理研究表明，火麻仁还具有杀虫、抗炎、抗血栓形成、抗心律失常、调血脂、抗肿瘤、抗溃疡等作用，有一定的毒性，临床常用于治疗便秘、术后胃肠功能恢复、神经性皮炎、高血压等[2-6]。

标准汤剂是以中医药理论为指导、临床应用为基础，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎液。火麻仁标准汤剂由火麻仁药材经炮制、提取、过滤、浓缩、干燥制备而成。本研究采用超高效液相色谱法(UPLC)建立了火麻仁标准汤剂的水溶性指纹图谱和脂溶性成分指纹图谱，为制定火麻仁配方颗粒质量控制标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

H dass型超高效液相色谱仪(沃特世公司)；MS105DU型十万分之一天平、万分之一天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；Synergy UV型超纯水系统(默克股份有限公司)；YMW型机械分体煎药壶(深圳一枚王有限公司)。

1.2 试药

火麻仁对照药材(批号：121097-201605)、对照品α-亚麻酸(批号：111631-201605，纯度：99.8%)、亚油酸(批号：111622-201203，纯度：99.8%)均购于中国食品药品检定研究院；磷酸、甲酸、乙腈、甲醇为色谱纯；乙醇为分析纯；水为超纯水。

参考《中华人民共和国药典》2015年版火麻仁项下炮制方法制成火麻仁饮片[1]，药材经广东一方制药有限公司质量中心鉴定，为桑科植物大麻CannabissatiraL.的干燥果实，具体信息见表1。

表1 火麻仁药材信息

2 方法与结果

2.1 火麻仁标准汤剂的制备

以国家中医药管理局发布的《医疗机构中药煎药室管理规范》为依据，制备火麻仁标准汤剂。取火麻仁饮片100 g，置于砂锅中，加水煎煮2次。第一次煎煮加8倍水，浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮30 min，趁热过200目筛滤过，滤液迅速冷却，备用；第二次煎煮加饮片量6倍水，武火煮沸后，文火煎煮20 min，趁热过200目筛滤过，滤液迅速冷却。合并2次滤液，65 ℃减压浓缩，浓缩至约200 g，冷冻干燥，即得。20批火麻仁标准汤剂样品编号为S1～S20。

2.2 火麻仁标准汤剂水溶性成分指纹图谱Ⅰ

2.2.1色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的CORTECS T3色谱柱(150 mm×2.1 mm，1.6 μm)；以乙腈为流动相A，0.1%甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱(0～5 min，0%A；5～15 min，0%～14%A；15～20 min，14%～90%A；20～20.1 min，90%～0%A)；流速为0.20 mL·min-1；检测波长为254 nm；柱温为30 ℃。

2.2.2参照物溶液的制备 取火麻仁对照药材约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水10 mL，称定质量，加热回流 60 min，放冷，用水补足减失的质量，摇匀，5000 r·min-1离心5 min(离心半径为30 mm)，滤过，即得。

2.2.3供试品溶液的制备 取火麻仁标准汤剂冻干粉约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10%甲醇水10 mL，超声(功率：500 W，频率：40 kHz)处理30 min，取出，放冷，用10%甲醇水补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm滤膜滤过，即得。

2.2.4方法学考察

2.2.4.1精密度试验 取火麻仁标准汤剂(S13)，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，按2.2.1项下色谱条件测定。分别计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果其RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.2稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液(S13)，按2.2.1项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、16、20、24 h进样。计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果RSD均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.4.3重复性试验 取同一批号样品(S13)，分别精密称取6份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果其RSD均少于2%，表明本方法重复性良好。

2.2.5火麻仁标准汤剂水溶性成分指纹图谱Ⅰ的建立

2.2.5.120批火麻仁标准汤剂水溶性成分指纹图谱Ⅰ的测定 分别精密吸取2.2.3项下制备的各批次供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定记录色谱图，结果见图1。

图1 20批火麻仁标准汤剂水溶性成分指纹图谱Ⅰ叠加图

2.2.5.2火麻仁标准汤剂水溶性成分对照指纹图谱Ⅰ的建立 采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)对20批火麻仁标准汤剂水溶性成分指纹图谱Ⅰ进行相似度分析，见图2。以3号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，见表2～3。结果表明，20批火麻仁标准汤剂水溶性成分对照指纹图谱Ⅰ相似度较好(>0.9)。

图2 火麻仁标准汤剂水溶性成分指纹图谱Ⅰ

表2 20批火麻仁标准汤剂水溶性成分指纹图谱Ⅰ相对保留时间

表3 20批火麻仁标准汤剂水溶性成分指纹图谱Ⅰ相对峰面积

2.3 火麻仁标准汤剂脂溶性成分指纹图谱Ⅱ

2.3.1色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的CORTECS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱(0～5 min，0%～25%A；5～10 min，25%～70%A；10～18 min，70%～100%A；18～21 min，100%A；21～21.1 min，100%～0%A)；流速为0.25 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为205 nm。

2.3.2参照物溶液的制备 取火麻仁对照药材约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水10 mL，称定质量，加热回流 60 min，取出，放冷，滤过，滤液置水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。另取对照品α-亚麻酸、亚油酸适量，精密称定，加甲醇制成10 μg·mL-1的混合对照溶液。

2.3.3供试品溶液的制备 取火麻仁标准汤剂冻干粉约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超声(功率：500 W，频率：40 kHz)处理30 min，取出，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm滤膜滤过，即得。

2.3.4方法学考察

2.3.4.1精密度试验 取火麻仁标准汤剂(S11)，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，按2.3.1项下色谱条件测定。分别计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果其RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.3.4.2稳定性试验 取火麻仁标准汤剂(S11)，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件，分别在0、4、6、8、12、20、24 h进样。计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果RSD均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4.3重复性试验 取同一批号样品(S11)，分别精密称取6份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果其RSD均少于2%，表明本方法重复性良好。

2.3.5火麻仁标准汤剂脂溶性成分指纹图谱Ⅱ的建立

2.3.5.120批火麻仁标准汤剂脂溶性成分指纹图谱Ⅱ的测定 分别精密吸取2.3.3项下制备的各批次供试品溶液1 μL，注入液相色谱仪，按照2.3.1项下色谱条件进行测定，结果见图3。

图3 20批火麻仁标准汤剂脂溶性指纹图谱Ⅱ叠加图

2.3.5.2火麻仁标准汤剂脂溶性成分对照指纹图谱Ⅱ的建立 采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)对20批火麻仁标准汤剂脂溶性成分UPLC图谱进行处理，自动校正后进行色谱法匹配，匹配结果见图4。以4号峰亚油酸为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积，见表4～5。20批火麻仁标准汤剂脂溶性成分指纹图谱与对照指纹图谱相似度较好(>0.9)。

注：3.α-亚麻酸；4(S).亚油酸。图4 火麻仁标准汤剂脂溶性对照指纹图谱Ⅱ

表4 20批火麻仁标准汤剂脂溶性成分指纹图谱Ⅱ相对保留时间

表5 20批火麻仁标准汤剂脂溶性成分指纹图谱Ⅱ相对峰面积

3 讨论

3.1 火麻仁标准汤剂水溶性成分指纹图谱Ⅰ

3.1.1色谱条件的选择 采用二极管阵列检测器(PAD)对样品进行全波长扫描，通过对比不同检测波长色谱图发现，当检测波长为254 nm时，火麻仁标准汤剂水溶性成分色谱峰最多，且各色谱峰的响应值均较高，因此选择254 nm为检测波长。另考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-0.1%甲酸水3种流动相的分离效果，结果表明，在乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱下，色谱图基线平稳，色谱峰分离度良好。以峰3为参照峰，20批火麻仁标准汤剂水溶性成分指纹图谱的其余5个特征峰相对保留时间RSD为0.7%～0.9%，均小于3.0%。

3.1.2水溶性指纹图谱Ⅰ的评价 本研究标示了火麻仁标准汤剂水溶性成分的6个共有峰，并通过相似度评价软件计算出20批火麻仁标准汤剂的对照图谱的相似度，结果均大于0.90。各批次火麻仁标准汤剂水溶性成分的图谱整体上基本一致。

3.2 火麻仁标准汤剂脂溶性成分指纹图谱Ⅱ

3.2.1色谱条件的选择 火麻仁油脂类成分如亚油酸、α-亚麻酸等成分分子结构中仅含有非共轭双键，因此只有末端吸收，在205 nm附近具有较强吸收，因此选择205 nm作为火麻仁脂溶性指纹图谱Ⅱ的检测波长。另考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水和甲醇-水3种流动相的分离效果，结果在乙腈-水梯度洗脱下，色谱图基线平稳，色谱峰分离度良好。以峰4亚油酸为参照峰，20批火麻仁标准汤剂脂溶性成分指纹图谱的其余3个特征峰相对保留时间RSD为0.2%～0.8%，均小于2.0%。

3.2.2脂溶性指纹图谱Ⅱ的评价 本研究标示了火麻仁标准汤剂脂溶性成分的4个共有峰，并通过相似度评价软件计算出20批火麻仁标准汤剂的对照图谱的相似度，结果均大于0.90。各批次火麻仁标准汤剂脂溶性成分的图谱整体上基本一致。

上述研究结果表明，不同产地火麻仁标准汤剂水溶性及脂溶性成分指纹图谱相似度均较高，说明不同产地火麻仁药材质量差异较小；研究建立的方法简单、重复性高，为评价火麻仁药材质量提供了新的方法，并为制定火麻仁配方颗粒质量标准提供了参考。