异丙酚通过糖原合成酶激酶-3β/β-连环素信号通路影响大鼠认知功能及海马神经元凋亡的实验研究

苏孟勤

近年来，儿科手术的开展越来越广泛，婴幼儿接触各类麻醉药物的机会也不断增加。儿童对手术的配合性较差，手术时首选的麻醉方式是全身麻醉，氯胺酮、咪达唑仑、异丙酚等全麻药物用于婴幼儿全身麻醉虽然能够取得确切的镇静效果，但也会对处于发育期的神经功能造成损害并可能影响成年后的神经功能[1-3]。异丙酚是全身麻醉中常用的短效静脉麻醉药物，具有起效快、苏醒时间短、持续输注后无蓄积效应等优势，用于麻醉诱导及维持、重症监护病房镇静等均能取得理想的效果。但是，异丙酚是否适用于婴幼儿手术的全身麻醉、对发育期的中枢神经系统是否产生毒性作用仍缺乏足够的数据支持。海马对学习、记忆以及认知等神经功能的发育具有重要意义，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)/β-连环素信号(β-catenin)已经在老年小鼠中被证实能够通过影响海马神经元的凋亡来造成神经功能的损害[4-5]。基于以上认识，本研究以新生大鼠为实验动物，探讨了异丙酚是否通过GSK-3β/β-catenin通路影响大鼠认知功能及海马神经元凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠：7日龄，体质量8～15 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005。饲养环境：温度为25 ℃、湿度为40%～50%。主要试剂：异丙酚购自意大利阿斯利康公司，GSK-3β抑制剂SB216763购自美国Sigma公司，TUNEL凋亡试剂盒购自美国ROCHE公司，GSK-3β、β-catenin、Bax、Bcl-2、Caspase-3一抗均购自美国CST公司。主要仪器：Morris水迷宫购自上海吉量科技公司，荧光显微镜及照相系统购自日本Nikon公司，Western blot电泳仪、显影仪购自上海天能公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药 30只实验大鼠随机分为3组：对照组、异丙酚组、异丙酚+SB216763组，每组10只。对照组给予1 mL生理盐水溶解腹腔注射，每天1次，连续7天；异丙酚组给予75 mg/kg异丙酚(1 mL生理盐水溶解)腹腔注射，每天1次，连续7天；异丙酚+SB216763组先给予10 mg/kg SB216763尾静脉注射液，而后给予75 mg/kg异丙酚腹腔注射，每天1次，连续7天。

1.2.2 水迷宫测试 干预结束后2周，进行Morris水迷宫测试，水迷宫直径110 cm，高度50 cm，被2条通过圆心且互相垂直的假想线分为4个象限，在一个象限内的水面下1 cm放置直径10 cm的平台。第1～5天进行定位航行实验，每只大鼠每天进行4次，每次间隔时间90 s，在第5天时记录大鼠在90 s内找到平台的时间，即逃逸潜伏期，及寻找平台路径的长度；第6天进行空间探索实验，撤出平台并记录大鼠在90 s内在平台所在象限内探索的时间以及穿越平台所在位置的次数。

1.2.3 细胞凋亡率测定 完成水迷宫测试后处死大鼠，解剖得到海马后将一半海马组织放入4%多聚甲醛中固定，而后在冰冻切片机上进行连续切片，厚度20 μm，裱于经明胶处理的玻片后用TUNEL试剂盒进行染色并在荧光显微镜的高倍镜下观察，绿色荧光的细胞为凋亡细胞，随机取10个视野并对凋亡细胞数目及细胞总数进行计数，计算细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数。

1.2.4 GSK-3β/β-catenin通路基因及凋亡基因的Western blot检测 取1.2.3中解剖得到的另一半海马组织，液氮冷冻后制备匀浆液，提取总蛋白，用BCA法对总蛋白定量后取50μg总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、抗体孵育，最后在显影仪中进行显影，以β-actin为内参对基因的相对表达水平进行定量分析。

2 结果

2.1 3组间Morris水迷宫测试结果比较 异丙酚组逃逸潜伏期和寻找平台路径长度长于对照组，探索时间和穿越平台次数均短于对照组；异丙酚+SB216763组逃逸潜伏期和寻找平台路径长度短于异丙酚组，探索时间和穿越平台次数均长于异丙酚组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组间Morris水迷宫测试结果的比较

2.2 3组间海马GSK-3β和β-catenin表达水平比较 与对照组相比，异丙酚组海马GSK-3β表达水平显著升高，β-catenin表达水平显著降低；与异丙酚组比较，异丙酚+SB216763组海马GSK-3β表达水平显著降低，β-catenin表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2和图1。

图1 Western blot检测3组海马中GSK-3β、β-catenin的表达水平。

表2 3组间海马GSK-3、β-catenin表达水平比较

2.3 3组间海马神经元凋亡率比较 对照组、异丙酚组、异丙酚+SB216763组海马神经元凋亡率分别为2.15±0.52%、13.37±2.31%、4.85±0.88%。3组比较差异有统计学意义(P<0.05)。异丙酚组、异丙酚+SB216763组及对照组的凋亡率依次降低，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 TUNEL试剂盒检测3组海马的神经元凋亡率

2.4 3组间海马Bax、Bcl-2、Caspase-3表达比较 异丙酚组海马Bax、Caspase-3表达水平高于对照组，Bcl-2表达水平低于对照组；异丙酚+SB216763组海马Bax、Caspase-3表达水平低于异丙酚组，Bcl-2表达水平高于异丙酚组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3和图3。

表3 3组间海马Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的比较

图3 Western blot检测3组海马中Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达水平。

3 讨论

多种全身麻醉药物对婴幼儿处于发育期的中枢神经功能具有损伤作用，异丙酚是常用的全麻药物，用于儿科手术的安全性仍未明确。本研究以7日龄大鼠为对象的Morris水迷宫测试结果显示，多次腹腔注射异丙酚后大鼠的各项Morris水迷宫测试结果均明显变差，海马中GSK-3β的表达增多、β-catenin的表达减少；而在注射异丙酚前给予GSK-3β抑制剂SB216763尾静脉注射能够使各项Morris水迷宫测试结果得到改善。GSK-3β对β-catenin具有抑制作用，GSK-3β受抑制后β-catenin的降解减少并发生蓄积[6-7]。本研究结果表明异丙酚能够造成新生大鼠的神经功能发生损害，并且引起GSK-3β表达增多，增加GSK-3β对β-catenin的降解是异丙酚产生神经损害作用的分子途径。

神经元凋亡是麻醉药物引起神经功能损害的重要途径[8-9]，本研究通过TUNEL法对海马中神经元凋亡的分析结果发现，多次腹腔注射异丙酚后7日龄大鼠的海马神经元凋亡率明显增加，而GSK-3β抑制剂能够使海马神经元的凋亡率下降。线粒体途径凋亡是细胞凋亡的重要机制之一，Bcl-2能够抑制线粒体途径凋亡，Bax能够促进线粒体途径凋亡，两者最终作用于Caspase-3并通过Caspase-3的活性来介导细胞凋亡[10-11]。本研究对海马中凋亡基因的结果发现：多次腹腔注射异丙酚后7日龄大鼠海马中Bcl-2的表达减少、Bax及Caspase-3的表达增加，而GSK-3β抑制剂能够使海马中Bcl-2的表达增多，Bax及Caspase-3的表达减少。以上结果表明异丙酚能够通过GSK-3β/β-catenin通路来促进海马神经元发生线粒体途径凋亡。