河南洛阳地区新生儿听力与耳聋基因同步筛查临床推广工作现状分析

郑锦胡书君王俊洲宋杰李海翠朱欢欢张莉莉陈红立席恺*

1河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院

2洛阳市妇女儿童医疗保健中心

3河南科技大学第三附属医院

耳聋是影响人类健康和造成残疾的常见原因，也是危害儿童身体与心理健康发展的疾病之一。国内外的研究表明，正常新生儿中，双侧听力障碍的发生率约在0.1%～0.3%，且某些地区的发病率处于逐步上升态势。据2012年《中国出生缺陷防治报告》显示，50%-60%的新生听障患儿是由遗传导致的，表明遗传因素是新生儿听力障碍的发生发展的重要影响因素[1]。随着听力筛查的深入开展和临床经验的积累，逐渐发现单一的听力筛查模式存在局限性，可能会漏诊相当一部分迟发性及药物性聋的患儿。广泛的听力与耳聋联合筛查是发现迟发型高危听障患儿最有力的策略[2]。通过联合筛查可以早期对筛查出的耳聋患者进行预警及耳聋防治知识的宣教；对耳聋基因携带者进行预警及遗传学咨询，可以有效预防和延缓耳聋发生[3]。我们分析了河南洛阳地区新生儿听力与耳聋基因同步筛查临床推广工作现状，以期发现当前同步筛查工作存在的问题及困惑，为今后工作的推动与改进提供现实依据。

1 研究对象

该研究共选取2016年9月～2018年9月间洛阳市区及周边县区（主要来源于栾川县、洛宁县、孟津县、汝阳县、嵩县、新安县、偃师、伊川县、宜阳县）来自洛阳市妇女儿童医疗保健中心，部分来自河南科技大学第一附属医院、河南科技大学第三附属医院的27900例新生儿作为听力筛查资料采集对象，其中的9068例新生儿作为听力与耳聋基因同步筛查研究对象。进行同步筛查的9068例新生儿中，男性4804例，女性4264例，男女比例为1:0.9；按照新生儿听力筛查技术规范（2010版）中听损伤高危因素中的界定，正常新生儿为8736例，听损伤高危儿为332例，两者比例为1:0.04。

2 研究方法

本研究经过洛阳市妇女儿童医疗保健中心、河南科技大学第一附属医院及河南科技大学第三附属医院医学伦理管理机构审核通过，在进行听力筛查、耳聋基因筛查前，告知每一位新生儿家长听力筛查及耳聋基因筛查的重要性及必要性，使他们充分理解筛查流程及筛查结果的局限性，确认理解后签署知情同意书。

2.1 听力筛查的策略

所有产科出生正常新生儿采用耳声发射（OAE）进行初筛，听损伤高危儿及复筛患儿均采用OAE和AABR联合筛查，实施两阶段筛查策略。正常新生儿出生后48-72小时，听损伤高危儿于病情稳定后或出院前进行初次听力筛查；初筛未通过者及漏筛者于42天内进行双耳复筛，复筛仍未通过者及高危新生儿于纠正胎龄3月龄转诊至洛阳市儿童听力筛查诊断中心行耳鼻喉专科检查、听力学、影像学综合诊断与评估。所有新生儿资料及筛查数据均于48小时内录入河南省免费筛查民生实事信息系统，以便后期随访及质量控制。

2.2 耳聋基因筛查方法

在新生儿出生3天后，在“两病（先天性甲减及苯丙酮尿症）筛查”采集足跟末梢血的同时，由产科专业护理人员采集滤干纸血斑标本。采用Qiagen公司干血斑核酸提取试剂盒进行核酸的提取，随后用基因微阵列芯片法进行常见耳聋基因热点突变的快速筛查。用晶芯LuxScanTM10K-B微阵列芯片扫描仪和晶芯耳聋基因检测分析系统进行信号的读取和判断。芯片点阵设计包括4个耳聋责任基因的9个热点变异：线粒体12SrRNA(m.1555A＞G、m.1494 C＞T)、GJB2(c.235delC、c.299 300delAT 、c.35delG、c.176 191del 16、)、SLC26A4(c.2168 A＞G、IVS7-2 A＞G)、GJB3 c.538 C＞T；耳聋基因筛查涉及主要设备有PCR扩增仪、晶芯BioMixerTMⅡ芯片杂交仪、晶芯SlideWasherTM芯片洗干仪、晶芯LuxScanTM10K-B微阵列芯片扫描仪和耳聋基因检测分析判别系统软件。

2.3 基因筛查阳性患儿复核验证

耳聋基因筛查阳性患儿血片均送检至北京博奥晶典生物技术有限公司聋病基因检测实验室，应用一代测序进行相应基因阳性位点复核验证。

2.4 听力诊断及综合评估

对听力筛查未通过及耳聋基因阳性患儿均进行听力诊断。包括病史采集及耳聋病历的建立；采用IHS公司的SmartEP诱发电位系统、SmartASSR多频稳态诱发电位系统、SmartOAE系统分别测试气骨导听性脑干诱发电位、多频稳态诱发电位、畸变耳声发射、40-HZ等项目；采用MAICO公司的MI-34声阻抗仪进行声导抗测试（7月龄以下使用1KHZ声导抗测试）；对确诊为听力障碍的患儿行颞骨薄层CT检查或MRI以及耳内镜等专科查体。

2.5 遗传咨询及随访方法

对于听力筛查和基因筛查结果异常者进行电话追踪随访，并参照国家卫生计生委新生儿听力筛查培训教材《新生儿听力筛查（第2版）》[4]中“新生儿及婴幼儿的听觉言语发育观察表”对每个患儿进行听觉、言语发育情况进行评估，并及时给予听力及遗传学个体化咨询与指导，督促患儿家长及时复诊，进行听力学及遗传学诊断与干预。

2.6 统计方法

所有数据录入Excel表进行数据整理，采用SPSS21.0软件对相关数据进行统计学分析，P＜0.05认定为有统计学差异。

3 结果

3.1 27900例新生儿总体听力筛查情况及基因筛查情况

本研究纳入27900例新生儿作为研究对象，其中26537例接受了新生儿听力筛查，筛查率为95.11%，初筛阳性率为5.58%，确诊听力障碍患儿43例，听力障碍患儿检出率为0.15%；大样本中9068例新生儿同期接受了耳聋基因筛查，筛查率仅为32.50%，筛查出耳聋基因阳性患儿453例，基因总体阳性携带率为5.00%，通过同步筛查最终确诊听力障碍患儿14例，听力障碍患儿检出率为0.15%，与大样本中聋病检出率无统计学差异（χ2=0.000，P=0.996）。9068例接受同步筛查的新生儿中，8736例为正常新生儿，基因筛查阳性携带率为5.00%（437/8736），332例为听损伤高危儿，基因筛查阳性携带率为4.82%（16/332），两者基因阳性携带率无统计学差异（χ2=0.023，P=0.881）。

3.2 8736例正常新生儿听力与耳聋基因同步筛查结果

8736 例正常新生儿中，听力筛查阳性率为3.49%(305/8736)，耳聋基因筛查阳性率为5.00%（437/8736）。听力筛查通过组耳聋基因阳性携带率为4.84%(408/8431)，听力筛查未通过组耳聋基因阳性携带率为9.51%（29/305），两者具有统计学差异（P＜0.001）基因筛查通过组听力筛查阳性率为3.33%（276/8299），基因筛查未通过组听力筛查阳性率为6.64%（29/437），两者具有统计学差异（P＜0.001）。

3.3 332例听损伤高危儿听力与耳聋基因同步筛查结果

332 例听损伤高危儿中，听力筛查阳性率为12.35%(41/332)，耳聋基因筛查阳性率为4.82%（16/332）。听力筛查通过组耳聋基因阳性携带率为4.47%(13/291)，听力筛查未通过组耳聋基因阳性携带率为7.32%（3/41），两者具有统计学差异（P=0.001）；基因筛查通过组听力筛查阳性率为12.03%（38/316），基因筛查未通过组听力筛查阳性率为18.75%（3/16），两者具有统计学差异（P=0.001）。

表1 8736例正常新生儿听力与耳聋基因同步筛查结果 (例，%)Table 1 8736 cases of normal newborn hearing and deafness gene screening results(CASE,%)

3.4 453例耳聋基因筛查阳性患儿基因变异结果

9068 例新生儿中，453例为耳聋基因筛查阳性携带患儿，总体基因阳性携带率为5.00%。453例耳聋基因筛查阳性携带患儿中，单基因杂合变异433例，单基因纯合变异及复合杂合变异12例，双基因变异8例

3.5 通过同步筛查确诊患儿听力损失分级及耳聋基因携带情况

截至2018年11月，聋病基因筛查阳性患儿共计有效随访370例，失访83例。目前行基因诊断2例，行听力学诊断28例，确诊为听障患儿14例，聋病检出率为0.15%(14/9068)。其中6例筛查出基因变异，3例为GJB2 235delC杂合变异，1例为c.235delCc.109G＞A复合杂合变异，1例为GJB2 299_300delAT杂合变异，均为轻到中度听力损失；1例为GJB2 235delC纯合变异，3月龄确诊为双侧极重度听力损失；8例未检出基因芯片筛查范围内的变异。目前发现1例SLC26A4基因IVS7-2A＞G杂合变异，但听力筛查通过个体，在进行听力随诊过程中，经颞骨薄层CT确诊为前庭水管扩大，目前行ABR测试显示双侧反应阈正常。

4 讨论

4.1 河南洛阳地区听力与聋病基因同步筛查临床推广工作现状

2017年7月1日起，河南省政府推出了免费新生儿听力筛查民生实事项目，全面建立了本省的新生儿听力筛查质控网络，实现了全省听力筛查资源共享、数据交流、质量控制统一化。在利好政策的推动下，洛阳市新生儿听力筛查工作从筛查覆盖面到筛查质量内涵都有了质的飞跃。截至2018年9月，河南省共有7家单位可进行新生儿聋病基因芯片筛查工作，而洛阳市仅有1家单位可开展同步筛查工作。该单位新生儿听力筛查工作和聋病基因筛查工作由不同部门技术人员分别开展，部门间相对独立，未实现信息共享；耳聋基因筛查工作缺乏系统的质量控制管理流程，实验室区域设置欠合理，实验室人员配备不足；针对筛查阳性样本仅对该阳性位点进行一代测序验证，未对筛查阴性样本进行随机抽查复检，存在假阴性的风险。目前洛阳地区尚无一个独立的耳聋基因遗传咨询门诊，筛查后遗传咨询专业人员匮乏，业务水平参差不齐，对同步筛查阳性高危儿家庭预警及宣教不到位。为后期高风险患儿听力及遗传学诊断及随访工作带来极大的困难，直接导致筛而不查、查而不治的尴尬局面，阻碍了听力与耳聋基因同步筛查模式的优越性的体现，本研究中通过同步筛查流程听力障碍患儿检出率为0.15%（14/9068），与大样本中通过单纯听力筛查流程聋病检出率0.15%（43/27900），无统计学差异（χ2=0.000，P=0.996）就印证了一点。

4.2 与近3年国内部分地区耳聋基因筛查结果对比分析（各地区均采用微阵列芯片法进行4个基因9个热点突变筛查）

本研究显示，洛阳地区现阶段新生儿耳聋易感基因检出率最高的变异类型依次为GJB2 235delC杂合变异，SLC26A4 IVS7-2A＞G杂合变异，GJB3 538C＞T杂合变异、线粒体12S rRNA 1555A＞G异质性变异。通过查阅文献，洛阳地区无论是耳聋基因筛查阳性总体检出率，还是4个责任基因的分别的检出率，均高于全国其他地区同期平均指标[6-16]，说明洛阳地区拥有数量众多的潜在听损伤高风险人群的存在，十分有必要尽快在本地区对所有新生儿进行普遍联合筛查工作，而且在不显著增加检测时间和人力成本的情况下，建议根据洛阳地区的基因变异频率，适当增加基因芯片检测位点，以期更多的新生儿受益[5]。

表2 332例听损伤高危儿听力与耳聋基因同步筛查结果 (例，%)Table 2 Hearing and deafness gene screening results of 332 high-risk infants with hearing impairment(CASE,%)

表3 453例耳聋基因筛查阳性患儿听力与耳聋基因同步筛查结果Table 3 Hearing and deafness gene screening results of 453 children with positive gene screening

4.3 听力与耳聋基因同步筛查模式在洛阳地区推广的优势分析

通过本研究中可以看出，洛阳地区现阶段新生儿总体基因阳性携带率为5.00%，是同期听障碍患儿的检出率（0.15%）的33倍，极大的拓宽了对高风险患儿的预警范围。通过听力筛查而同期基因筛查阳性的患儿，在正常新生儿和听损伤高危儿中均占据一定的比例，再次印证了只进行单纯的听力筛查，将遗漏相当比例的听力损失潜在高风险人群，通过联合筛查可以早期对筛查出的耳聋患者进行预警及耳聋防治知识的宣教，对耳聋基因携带者进行预警及遗传学咨询，可以有效预防和延缓耳聋发生[3]。与此同时，通过本研究还发现，听力筛查未通过组聋病基因阳性携带率高于听力筛查通过组，基因筛查未通过组听力筛查阳性率高于基因筛查通过组，提示基因筛查与听力筛查可以相互补充，如果由于各种原因不能同期开展，听力筛查确定异常的儿童应该进一步听力诊断，如仍为听力异常，则需要耳聋基因诊断，而不建议进行常见耳聋基因热点变异的筛查。

4.4 耳聋遗传咨询的复杂性是我们面临的巨大挑战

自1997年Kelsell[17]发现GJB2基因突变可导致非综合型感音神经性聋以来，关于GJB2基因结构功能及其不同突变类型导致不同听力表型的研究从未停止过。以往关于该基因变异致聋的机制多集中在GJB2所编码的Cx26蛋白的功能丧失，从而导致内耳细胞间缝隙连接通道通透性下降，直接影响钾离子在复极相回流入内淋巴，最终造成Corti器局部钾离子中毒而发生耳聋[18]。近年来，经典的“钾离子循环障碍学说”逐渐被动摇[19]，有学者认为Cx26蛋白缺陷造成耳聋的主要机制是其对细胞间信号转导，细胞活力的影响，主张Cx26蛋白缺陷的致聋机制不仅要从病理生理角度考虑，还要从细胞水平考虑[20]。正是由于GJB2基因致聋机制的复杂性，所以表现出了高度的遗传异质性，即使是GJB2 235delC纯合变异这一种变异类型，所导致的听力发病年龄，听力损失程度及双耳听损对称性均存在多样性[21]。本研究在阳性病例复合验证时检出了GJB2 109G＞A/235delC复合杂合变异，GJB2 109G＞A杂合变异等变异类型，王现蕾等[22]在关于GJB2基因变异引起听力变化的综述中指出：GJB2基因致聋变异的多种基因型可导致渐进性听力损失，其中GJB2 109G＞A变异的检出率高于其他变异类型，建议对这类患者加强随访。综上所述，遗传异质性的存在无疑加大了遗传咨询的难度，针对本地区携带率最高的GJB2基因的患儿的听力随访及遗传学咨询的任务十分艰巨，在基层医院如何早期及时发现并干预这些患儿，是我们今后工作的重点。

本研究中发现洛阳地区第二位高发的变异基因为SLC26A4基因，其阳性携带率为1.47%。SLC26A4基因定位在7q31，在耳蜗、前庭和内淋巴囊均有表达。SLC26A4编码的Pendrin蛋白，是一种跨膜蛋白，主要介导CL-,HCO3-,I-的离子转运，对维持内淋巴液的电解质平衡起到极其重要的作用[23]。该基因变异可导致NSHL，伴有前庭水管扩大的NSHL以及伴有前庭水管扩大/甲状腺肿的神经性耳聋，即Pendred综合征[24]。SLC26A4基因变异导致的听力损失在临床中表现为迟发型，波动性下降的特点，有相当一部分后期确诊为大前庭水管综合征的孩子，在出生时听力正常，通过了听力筛查。本研究中共筛查出SLC26A4 2168A＞G杂合突变24例，初筛通过率为91.67%；SLC26A4 IVS7-2A＞G杂合突变109例，初筛通过率为97.25%，就印证了上述特点。目前针对SLC26A4基因阳性携带者的早期随访，我们在尚无条件开展基因测序的情况下，仍采取于患儿3月龄行ABR检测，如果观察到声诱发短潜伏期负反应[25]；或者排除中耳功能异常后，ABR检查结果显示为重度至极重度双耳不对称性听力损失的情形下，强烈建议患儿早期行颞骨薄层扫描，并结合聋病基因筛查结果进行初步诊断及遗传咨询。对确诊患儿及时发放LVAS患儿听能管理注意事项卡片，告知家长在患儿听力波动时及时就诊，根据听力下降程度进行药物、助听器或人工耳蜗植入干预。

表4 14例确诊患儿听力损失分级及聋病基因携带情况Table 4 Hearing Loss Classification and Deafness Gene Carrier in 14 Children with Confirmed Diagnosis

听力与耳聋基因联合筛查除了早期发现那些迟发性、渐进性耳聋患儿之外，其突出的优势在于能够发现药物敏感性耳聋患者，并对其家庭母系成员进行全覆盖预警。据研究显示位于mtDNA12sRNA基因的m.A1555G和m.C1494T位点是氨基糖苷类药物导致耳聋的重要热点突变。其发生变异后，导致mtDNA12sRNA的二级结构与大肠杆菌E.cloi16sRNA的二级结构相仿，与氨基糖苷类药物的亲和力增加，从而影响相关蛋白质的合成而致聋[26-27]。与此同时我们也认识到线粒体遗传不同于经典的孟德尔遗传，它具有母系遗传特征，而且由于线粒体“遗传瓶颈”、遗传异质性、阈值效应、核修饰基因的存在，导致线粒体基因变异携带者在未接触或接触氨基糖苷类药物后听力表型也存在较大差异[28]。戴朴[29]等在对18个省市聋校线粒体DNA 12sRNA基因的m.A1555G突变筛查报告中指出，部分携带者虽然服用过氨基糖苷类药物，却未出现严重听力损失；刘日渊[30]等的一项研究显示：线粒体DNA12sRNA基因变异家系中，存在对氨基糖苷类药物不敏感个体，MTO1为可能的核修饰基因。我们在随访中发现1例携带m.1555A＞G均质性突变且有耳聋家族史的患儿，其母亲系耳聋伴智力障碍，我们发现患儿姐姐及其姨妈虽然也服用过氨基糖苷类药物，但是目前听力及言语交流情况正常，与上述研究结果一致。目前已为筛查出线粒体DNA12sRNA基因突变的21位新生儿家长，发放了药物性耳聋预警卡片，并定期进行了电话随访，其中2例听力初筛阳性患儿已经通过复筛；21例基因阳性患儿目前听力及言语发育状况良好。但是另有研究显示，一部分携带者在未使用氨基糖苷类药物的情况下，仍会出现不同发病年龄不同程度的听力下降[31]，所以我们将持续关注21例线粒体基因阳性患儿携带者的听力走势，向患儿家长合理解释各种可能发生的情况，使他们具有正确的心理预期，避免医疗隐患的发生。

GJB3基因是由我国夏家辉院士在国际上第一个克隆并定位于1P33-35的基因，它同样编码的是缝隙连接蛋白，该基因变异可能会导致常染色体显性遗传性耳聋，主要表现为后天高频性听力下降。李庆忠等[32]在141例非综合征型遗传性聋患者中进行GJB3基因变异携带情况的研究发现，该基因携带率为17.2%，发现携带GJB3基因的患者会出现迟发性型的高频区域的听力损失。但是近年来越来越多的研究显示，我国聋人群体中GJB3基因的变异率并不高[33]。Huang等[34]在对中国人群GJB3 c.538C＞T突变与听力表型的关系的研究中发现，在5700例聋人样本中，GJB3 c.538C＞T杂合突变的检出率为0.40%（23/5700），且通过病史采集发现，这些携带者均为散发病例，无耳聋家族史。与此同时47.82%（11/23）携带者检出其他基因（GJB2/SLC26A4）的变异。大多数患者表现为中度至重度听力损失。而4600例听力正常对照组中GJB3 c.538C＞T杂合变异检出率为0.24%（11/4600），试验组与对照组发病率无统计学差异。该研究显示GJB3 c.538C＞T突变在中国人群中的发病率很低，而且GJB3 c.538C＞T突变在引起非综合征性常染色体显性耳聋中的作用没有足够的临床证据支持。

综上所述，耳聋基因与听力联合筛查的优越性早已在众多研究中所证实[35-36]。包括洛阳在内的基层医疗机构，阻碍听力与耳聋基因同步筛查普遍开展的原因包括：筛查费用偏高、筛查基础设施及设备不足，从业人员数量及其遗传学知识的匮乏等多种因素。洛阳地区听力基础保健工作现状，只是众多低收入及中等收入地区严峻听力残疾防治形势的缩影。WHO[37]针对全球日益严重的听力残疾问题，制定了不同年龄阶段人群听力损失的三级预防措施；并就在经济落后地区如何削减听力残疾防治成本，制定了不同层面的干预策略。这些措施和策略对于改善洛阳地区的联合筛查现状具有指导性意义。在后续的研究中，我们将不断积累并完善基层医院在医疗技术水平有限及地区经济落后的条件下的听力与遗传联合咨询及随访的经验，尽最大可能将听力筛查、聋病基因筛查、耳科专科检查结果进行资源整合，细化联合筛查及后续诊断、随访流程，以期对同步筛查阳性高危险患儿进行个体化精准听力与遗传学指导与干预。