蛹虫草优良菌株的筛选

郭尚，徐莉娜,，李艳婷，周伟，陈楠，张生万，李银生

(1.山西省农业科学院 食用菌研究所，山西 太原 030031；2.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；3.山西师范大学 生命科学学院，山西 临汾 041000；4.山西省太原市阳曲县农委，山西 太原 030100)

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)，别称北虫草，与野生冬虫夏草同属肉座菌目(Hypocreales)[1]。蛹虫草资源生态分布广阔，我国主要分布在辽宁、陕西、广西、福建、甘肃等地区；国外主要集中在法国、德国、英国、美国以及加拿大等国家的一些地区。蛹虫草营养价值丰富，富含多种活性物质，如虫草素、虫草酸、虫草多糖、多酚等，在抑制肿瘤、抗疲劳、提高人体免疫力等方面起到重要作用[2,3]。有研究对比分析蛹虫草与冬虫夏草的化学成分及营养价值，结果发现两者化学成分含量相当，而且有些对人体有益成分的平均含量还要高于冬虫夏草，这一发现使得蛹虫草可作为冬虫夏草的良好代替品进行生产和消费[4]。

蛹虫草因生态适应性较强，现已在全国各地实现规模化生产，山西吕梁有多家公司投资种植。食用菌培育的关键在于菌种的选择，菌种的优劣在很大程度上决定了生产的效益。本实验团队在日常指导蛹虫草培育中发现，蛹虫草菌株退化现象严重，即使最初引进的是最优菌株，在出草2～3个周期之后，一些出草周期延长，一些出草率降低或者长出畸形子实体，有的甚至没到成熟期就停止生长，出现白化现象。蛹虫草菌种退化严重是目前虫草产业存在的普遍问题，因此亟待高效稳产菌株解决此问题[5]。

为解决菌种退化问题和选育适于山西省境内培育的优良菌种，本研究对不同来源的9个蛹虫草菌株进行了菌丝生物学特性研究、液体菌种制备、出菇筛选等试验，以期获得高效稳产的优良蛹虫草菌株，为推进山西省虫草产业的发展提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

本试验所用菌株(1号、2号、5号、6号、7号、8号、9号)由山西省农业科学院食用菌研究所提供，菌株(3号、4号)由中国科学院微生物研究所提供。

1.1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，自来水1 000 mL，自然pH。

液体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1.5 g，KH2PO41.5 g，自来水1 000 mL，自然pH。

培养基灭菌条件：121 ℃，灭菌 25 min。

1.1.3 供试菌种制作

固体菌种：用接种棒挑取虫草菌菌块接种到PDA平板培养基中心位置，放置恒温培养箱中，22 ℃避光培养，进行活化。活化好的菌株采用直径8 mm的打孔器打取1块，接种至PDA平板培养基中心位置，放置恒温培养箱中，22 ℃避光培养，待菌丝体布满平板二分之一时，备用。

液体菌种：用直径5 mm的灭菌打孔器在PDA平板上选取5块带培养基的菌块接种至含有100 mL液体培养基的三角瓶(容量250 mL)中，置恒温摇床，22 ℃，135 r·min-1，避光培养3 d左右，待出现颗粒菌球，均匀悬浮在液体培养基中，即液体菌种。

1.2 试验方法

1.2.1 菌落培养

选取蛹虫草菌块接种至PDA平板中央，置于光照培养箱(100 Lux)，22 ℃培养5 d后，每隔2 d观察记录菌丝形态，并量取菌落直径。

1.2.2 液体培养

取相同量的菌块置于摇瓶中，液体培养3 d后，培养液过滤，所得菌丝体在65 ℃条件下烘干至恒重，记录重量。

1.2.3 人工栽培试验

栽培试验在山西省农业科学院食用菌研究所栽培温室进行。栽培容器采用高15 cm、直径8 cm的组培瓶，用无菌透气膜封口。将菌球大小均一、无污染的液体菌种用无菌水稀释2倍，8层纱布过滤即为栽培种。选取新鲜无霉变大米20 g，加入20 mL液体培养基，121 ℃灭菌45 min，冷却至室温接种，接种量以2 mL为宜，用无菌微量注射器接种于基质表面，接种完成后，透气膜封口，置于发菌室，18 ℃黑暗条件下发菌。待基质表面出现白色凸起进行22 ℃培养并提供光照进行转色，转色完成后，在封口膜上均匀打孔增大通气量，促进子实体生长。观察记录不同菌种子实体的出草时间以及子实体的形态。

1.3 数据处理

用 SPSS.16.0进行实验数据统计分析，方差分析采用单因素方差分析法(LSD)进行，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 各菌株在培养基上的菌丝生长情况

由表1可见，来源不同的9株虫草菌在PDA平板培养基上的生长速率和菌落形态存在明显差异，日均生长速度范围在1.98～3.75 mm之间；生长初期，菌丝处于适应期，生长缓慢，各个菌株生长速率差异不明显，到了培养后期，由于各菌株生物学的特异性，长势差异明显。其中 1号、6号、7号和9号菌株的菌丝生长一直处于平缓状态，菌落边缘不平整，且菌丝颜色较淡； 2号、4号和8号菌株在培养后期菌丝生长速度加快，这说明菌丝对培养环境有一定的适应期，等完全适应了新环境之后，生长速率加快，进一步说明该3株菌的菌丝适应能力强，生长周期结束之后，菌落边缘整齐、菌丝呈绒毛状、淡黄色；3号和5号菌株生长速率较慢，菌落不规则，菌丝稀疏呈放射状。

表1 不同菌株菌丝生长试验结果Table 1 Results of different strains on mycelia growth 单位：mm

2.2 各菌株在液体培养基中的菌丝生长情况

不同菌株液体培养所得菌丝生物量测定结果见图1。9 株菌菌丝生物量在0.28 ～0.89 g范围之间，差异显著。其中3号和6号菌株的生物量较小，说明液体培养菌丝生长能力较弱；8号和9号菌株的菌丝生物量较大，其中 8号菌株的菌丝生物量最大；1号和2号菌生物量相近，说明这两株菌在液体培养基中的长势一样；4号、5号和7号菌株生物量相差不大，说明这3个菌株对液体培养条件的适应性一致。综上可知，9株菌种的生长趋势为：8号>9号>2号>1号>4号>5号>7号>3号>6号。

图1 不同菌株菌丝体生物量试验结果Fig.1 Rsults of different strains on mycelium biomass

2.3 各菌种栽培蛹虫草试验

2.3.1 不同菌株子实体形态描述

不同菌株子实体形态描述：1号菌株子实体呈橙黄色，柄短、粗，有子囊壳，部分头部发白；2 号菌株子实体淡黄色，柄稍弯曲、较细，有子囊壳，长势稀疏； 3 号菌株子囊壳少，颜色橘黄，出草整齐均匀，出草率高，柄较短，粗细均匀，出草疏密度适当； 4号菌株子实体橘黄色，柄粗短，小尖头；5号菌株子实体淡黄色，柄细高、光滑，根部粗；6号菌株子实体橙黄色，柄矮、粗，头部细小，有子囊壳，部分头部发白；7号菌株子实体橘黄色，柄弯曲扁平，有子囊壳，出草不均匀；8号菌株子实体淡黄色，子囊壳丰富，头部发白，出草整齐均匀，出草率高，柄粗细均匀，出草疏密度适当；9号菌株子实体稀少，出草率低，基质布满绒毛状菌丝(表2、图 2)。

图2 不同菌株子实体形态Fig.2 The morphology of fruiting body of different strains

2.3.2 不同菌株人工栽培试验结果

由表2可见，1号、2号、3号、6号、8号和9号菌株原基出现时间相近，且1号和2号菌株转色时间一致，生长速率一致，最终子实体鲜重也相近；但3号、6号和8号菌株转色时间较长，生长速率差异明显，最终结实周期也不相同，新鲜子实体重量以8号菌最高，3号菌次之；9号菌起初生长状态与其余菌种相似，但最终结实率不高，菌丝体布满基质表面。4号、5号和7号菌株原基出现时间较长，均在9 d以上，4号菌株所需转色时间少，但3株菌生长速率相近，生长周期完成后，5号菌子实体长势最好，7号菌污染严重。

由以上试验结果可知，不管是固体培养、液体培养，还是人工栽培，8号菌株均表现出了良好的适应性和较好的生长趋势，因此8号菌可以作为优势菌株进行生产和推广应用。

3 讨论与结论

通过对 9 株蛹虫草菌株的菌丝形态和生长速率、液体培养生物量以及子实体形态、重量、采收周期以及污染率的对比研究，最终筛选出 8 号菌株为最佳生产菌种，其菌丝萌发快、长势好，液体培养生物量积累量高，子实体形态优良、产量高，污染率较低。

菌种退化问题是目前蛹虫草产业生产中面临的最普遍难题[6]。菌种退化是不可逆的，而且这种退化还具有可遗传性，这不仅会造成当期蛹虫草生产质量受阻，还会直接影响菌种质量，给后续的批量生产带来极大的风险。如何克服蛹虫草菌种退化技术难题问题已成为国内外学者研究的焦点[7]。一旦菌种出现退化现象，其最明显的表现就是菌丝体培养阶段出现原基时间延长，原基量少且大小不均一；除此之外，转色期延长或直接不转色，导致后续出草管理时，迟迟没有子实体长出，或者长出形态各异、长短不一、粗细不等、颜色不均的畸形子实体[8]。更有甚者，还会有白色子实体出现，这可能与虫草菌菌丝体色素减少有关。有研究者对退化菌株做了详细显微观察，结果显示，对于出现了退化现象的菌株，其差异不仅表现在外观上，即原基不转色或转色不彻底，其内在的结构亦发生了变化，比如退化菌株菌丝纤细、弯曲，在显微镜下孢子粘连在一起呈头状、山丘状，而正常菌株菌丝挺立、粗壮，分生孢子呈念珠状[9]。另外，有研究表明退化菌株子实体颜色发生变化主要与菌株本身的脱氢酶活性有关[10]。关于蛹虫草菌种退化的机理有很多说法，但主要集中在核型改变、基因突变和有害物质积累方面。单就蛹虫草子实体培育过程所需的营养条件及管理原则来看，其子实体是否能够正常发育主要有2方面的原因：一是菌种选择；二是培养条件的设定[11～14]。而这2个因素都可以人为改变，所以选育高效优产的蛹虫草菌株指日可待。

表2 不同类型菌种栽培蛹虫草试验结果比较Table 2 Comparison of experimental results of different strains

在本研究中，我们仅对现有蛹虫草菌种进行了简单筛选，采用的是常规的组织分离法，并没有从遗传学方面对菌种进行修饰，不能保证菌种的优势特征在后续的生产中可以持续稳定遗传，而且传代试验也只进行到第三代，因此如果要采用此菌种进行大规模生产，还需进一步的研究，务必从遗传学方面进行干预，保证菌种的优良性状可以稳定遗传。