褐藻多酚对铅胁迫下上海青生长及抗氧化系统的影响

耿志刚 韩西红 赵丽丽 张 琳 秦益民 陈 铭 王晓辉

（1 青岛明月海藻集团有限公司 山东青岛 266400；2 农业农村部海藻类肥料重点实验室 山东青岛 266400；3 海藻活性物质国家重点实验室 山东青岛 266400）

随着采矿、冶炼等工业的发展，重金属污染问题日益严重，其中Pb 是危害植物生长发育，危害人体健康的剧毒元素之一，也是毒性最强的重金属元素之一［1］。此外，一些城郊、污灌区甚至果园的土壤中含铅量也比较高［2］。铅不是植物生长发育的必需元素，当铅被动进入植物后，会在根、茎和叶组织中积累，破坏细胞膜通透性，引起光合作用、呼吸作用等代谢过程紊乱，植物地上部分生物量下降，叶片失绿明显，严重时逐渐枯萎，导致植物死亡［3］。铅的积累量也直接影响细胞的代谢，引起活性氧对代谢酶系统的破坏作用；高浓度铅还会降低种子萌发率，抑制胚根胚轴的生长，甚至出现胚根组织坏死［4］。

研究表明，植物在正常情况下，活性氧的氧代谢保持动态平衡。植物受到胁迫时，细胞内自由基的产生和清除之间的平衡受到破坏，导致大量的活性氧自由基产生，自由基引发膜中不饱和脂肪酸产生过氧化反应，破坏膜的结构和功能［5］。Pb 胁迫和其它胁迫相似，当植物生长过程中遇到重金属胁迫时，重金属可作诱导剂引起膜脂质过氧化，细胞内自由基的产生和清除之间的平衡受到破坏，使大量的O2-·、OH-·、NO·、HOO-·等自由基产生，使蛋白质和生物大分子变性、细胞膜脂过氧化加剧，伤害植物。目前，认为活性氧水平升高导致的膜脂过氧化加剧是膜损伤的重要原因［6］，膜质过氧化反应主要的是由氧自由基启动，经连锁反应生成氧化终产物丙二醛。因此，丙二醛（MDA）的积累在一定程度上反应了体内自由基的动态效应。目前，MDA 已被广泛用作衡量膜质过氧化损伤的指标［7］。

重金属处理能够引起植物保护酶系统过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性发生变化［8］，说明重金属胁迫使活性氧自由基增多，膜脂过氧化加剧，其中SOD活性在一定范围内与细胞内的活性氧自由基水平呈正相关，而POD 的活性则与植物体内重金属含量呈正相关。大量研究证明，重金属离子浓度越高，MDA 积累越多，呈密切的正相关。MDA 和OH-·等在植物中都可以对细胞产生损害［9］。重金属对植物的伤害是通过自由基介导，重金属毒害试验中，加入自由基清除剂（苯甲酸、抗坏血酸等）可以有效降低重金属对植物的毒害及MDA 的生成［10］。

海藻的生活环境十分复杂，经常出现结构缺失和生理活性遭到损伤等。然而，海藻自身细胞的适应能力非常的强，可以通过产生次级代谢产物，保护自身免受氧化应激的损伤［11］，海藻产生的这种次级代谢物具有特殊的结构和功能，是非常宝贵的海洋资源［12］。其中，海藻多酚类化合物是一种很好的天然抗氧化剂具有较强的抗氧化活性［13］。

褐藻多酚是存在于褐藻中比较常见的一种多酚类化合物，主要是通过醋酸-丙二酸途径，以间苯三酚为单元进行生物合成得到的低聚物。褐藻多酚的羟基与水能形成氢键，是水溶性很强的化合物，且它们的分子质量为126～6 500 kDa［14］。与其他多酚类化合物相似，褐藻多酚也有多种生物活性，例如抗炎、抗癌、抗菌、抗氧化及血管紧张Ⅰ转化酶抑制作用等，其中抗氧化活性的功能较为突出［15］，其对重金属有较强的螯合作用，有效降低重金属对细胞的损害［16］。植物中多酚类物质能有效清除超氧化物自由基，降低植物在逆境下机体受到的伤害［17］。褐藻多酚在植物上应用研究还比较少，尤其是在增加作物对重金属的耐受性方面，笔者通过对上海青小油菜进行Pb 胁迫处理，通过使用不同浓度褐藻多酚处理，测量其抗氧化指标及农艺性状指标，测试褐藻多酚在农业上的应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验在农业农村部海藻类肥料重点实验室功效研究室进行。供试肥料为青岛明月海藻集团有限公司生产的有机无机复混肥（16-8-16）；褐藻多酚提取物呈黑褐色液态多酚总量为30%，由明月蓝海生物科技有限公司提供。供试土壤为棕壤，取自青岛明月海藻集团有限公司试验田，有机质含量16.23 g/kg，全氮1.13 g/kg，有效磷含量72.56 mg/kg，速效钾含量70.31 g/kg，pH值5.18。土壤Pb 含量85 mg/kg。供试品种为‘上海青’小白菜。于4月18号播种育苗，生长周期50 d。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

本试验为盆栽试验。在试验田取5～20 cm 表层土，晾晒风干后过2 mm 筛备用。以溶液形式加入Pb（NO3）2，Pb 浓度为1 200 mg/kg，处理浓度分别以纯Pb 计。以不加Pb 处理作对照。土壤加入Pb 溶液后，充分混匀，保持土壤持水量60%，平衡10 d，然后风干装盆，每盆盛土5.0 kg。每盆施有机无机复混肥1 kg，每个处理重复3 次，随机区组排列。试验设置7 个处理：CK，不胁迫，不施用褐藻多酚；T1，1 200 mg/kg Pb 胁迫处理，不喷施褐藻多酚；T2，不胁迫，喷施500倍稀释褐藻多酚；T3，Pb 胁迫，褐藻多酚提取物500 倍；T4，Pb 胁迫，褐藻多酚提取物1 000 倍；T5，Pb 胁迫，褐藻多酚提取物1 500倍；T6，Pb胁迫，褐藻多酚提取物2 000 倍。移栽两叶一心上海青幼苗，每钵3株，分别在移栽后的第10天、第20天和第30天时，按照试验设计喷施褐藻多酚提取物，每天用去离子水浇灌，保持60%的田间持水量。每处理重复3次，随机排列。培养35 d后，测量叶片的过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性以及丙二醛（MDA）含量，50 d 收获测定生物量鲜重及叶片SPAD 值、植株体内Pb含量。

1.2.2 测定项目及方法

过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及丙二醛（MDA）含量均采用试剂盒方法测定（购自南京建成生物工程研究所）。采用羟胺氧化法测定O2-·产生速率。收获时使用SPAD502仪测量叶片SPAD值，电子天平测量鲜重生物量。数据处理采用Microsoft Excel 2003 软件处理数据和绘制图表，采用DPS705 软件进行统计分析，采用最小显著极差法（LSD）进行差异显著性检验（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同处理对Pb胁迫下油菜体内酶活性的影响

植物在生长过程中难免会遭受生物和非生物逆境胁迫，其代谢过程就会产生自由基破坏细胞膜；POD、SOD、CAT 作为植物自身的酶保护系统，可通过各种代谢过程来清除自由基，降低氧化损伤［18］。在一定程度上清除各种逆境因子胁迫下所产生的活性氧，使体内活性氧维持在一个相对稳定的水平，从而有效地阻止过氧化物质在植物体内积累。表1结果是在不同处理下，褐藻多酚对Pb 处理模拟重金属胁迫下酶活性恢复的影响。Pb 胁迫下，SOD、POD 和CAT 活性的影响含量低于对照（CK），说明叶片受到重金属离子胁迫后抗氧化酶活性发生改变，上海青植株体内的氧化酶活性系统遭到破坏。正常处理下施用褐藻多酚提取物处理（T2 组）的SOD 酶活性显著高于对照处理，而POD 和CAT 与对照差异不显著。Pb 胁迫下，用不同稀释浓度的褐藻多酚提取物处理的SOD、POD和CAT含量均高于1 200 mg/kg Pb胁迫不喷施褐藻多酚（T1）处理。且稀释倍数越大，3种酶的活性越低，1 000倍稀释时SOD 和CAT 活性与CK 组处理相比，无显著差异，500倍稀释时，3种酶的活性与CK 相比，均没有显著差异。以上结果说明，褐藻多酚提取物能显著提高上海青油菜SOD 酶的活性，高浓度处理时明显缓解了Pb 胁迫对油菜体内POD、SOD 和CAT 活性的抑制作用，缓解了Pb 胁迫造成的氧化损伤，提高了油菜的抗氧化能力，增强了油菜抵抗Pb胁迫的能力。

2.2 不同处理对上海青叶片MDA含量的影响

MDA 是在植物器官衰老或逆境条件下，发生膜脂过氧化作用而产生的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。由图1 可知，Pb离子胁迫不喷施褐藻多酚下（T1），上海青幼苗叶片MDA 含量显著高于CK 组处理，说明上海青小白菜受到重金属离子胁迫而累积了大量的MDA，是CK 组的两倍之多。非Pb 胁迫下施用褐藻多酚提取物处理（T2），MDA 含量与CK 组相比并无显著差异。在Pb 离子胁迫下，施用不同褐藻多酚提取物处理的MDA 含量相比不施用海藻提取物处理显著下降，且随着褐藻多酚提取物稀释浓度的增大，MDA 下降的越慢，500 倍稀释倍数下效果最好，但仍高于正常对照处理，说明Pb 胁迫下施用褐藻多酚提取物对于降低叶片MDA 含量具有较好的作用，但不能完全清除重金属铅（Pb）造成的MDA积累。

表1 不同处理对上海青幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

图1 不同处理对上海青叶片MDA含量的影响

2.3 不同处理对·产生速率的影响

图2 不同处理对上海青体内O2-·产生速率的影响

2.4 不同处理对上海青生物量鲜重的影响

由图3可知，在处理50 d后，Pb离子胁迫不喷施褐藻多酚下（T1）的上海青苗鲜重显著低于正常对照及其他所有处理，其中非胁迫下褐藻多酚500 倍喷施处理（T2）与CK 处理相比鲜重有所增加，但无显著差异，Pb 胁迫下施用褐藻多酚提取物处理（T3、T4）生物量鲜重比T1 生物量鲜重有显著性差异，但也显著低于CK。1 500倍稀释以上（T5、T6）生物量鲜重与T1 相比无著性差异。这些结果表明，Pb胁迫抑制了上海青生物量鲜重积累，施用褐藻多酚取物有利于促进上海青生长，高浓度喷施时，一定程度上可以缓解Pb胁迫带来的不利影响。

图3 不同处理对上海青鲜重的影响

2.5 不同处理对Pb 胁迫下上海青植株内Pb 含量的影响

由图4可见，与对照相比，Pb离子胁迫不喷施褐藻多酚下（T1），上海青植株叶片和根系内Pb含量明显增加；使用不同浓度的褐藻多酚提取物处理上海青植株后，均可降低了油菜叶片和根系内Pb 含量；使用稀释500、1 000 和1 500 倍褐藻多酚喷施处理时，油菜叶片和根系内Pb含量显著降低；稀释500 倍褐藻多酚（T2）处理与单独Pb 胁迫（T1）处理相比，上海青叶片和根系内Pb含量分别显著降低了67.5%和48.1%。以上结果表明，褐藻多酚提取物稀释浓度1 000 倍以内时，均能显著降低上海青植株体内Pb 的水平，可有效缓解重金属Pb对上海青的胁迫毒害作用。

图4 不同处理对上海青Pb含量的影响

2.6 不同处理对上海青叶片SPAD值的影响

由图5 可知，Pb 胁迫处理的上海青幼苗叶SPAD值显著低于对照组及其他所有处理，其中T2和T3两个处理显著高于Pb胁迫（T1）处理，且与正常对照处理无显著差异。这些结果可以说明，Pb 胁迫下上海青叶片叶绿素含量降低，植株叶片出现黄化现象，而施用褐藻多酚提取物的处理可以提高叶绿素含量，从而促进光合作用，减轻重金属所致的黄化现象。

图5 不同处理对上海青叶片SPAD的影响

3 结论

土壤重金属超标是农业种植过程中常见的问题，也是造成作物不良生长的重要因素之一［20］，重金属离子造成的伤害大多数与超氧阴离子自由基等活性氧有关，植物在重金属超标的土壤中，会加速活性氧物质的积累，增加膜脂过氧化和提高膜的渗透性，造成膜系统损伤［21］。

超氧化物歧化酶（SOD）是一种存在于动植物体内的天然超氧自由基清除因子，它可以把对细胞有害的超氧自由基向过氧化氢转变，之后在过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的作用下，将过氧化氢分解为对作物无害的水，避免超氧自由基多植物膜脂造成的损伤［22］。外源海藻提取物处理后的烟草幼苗，在植株生长受到胁迫时可明显提高叶片的相对含水量和叶绿素的含量，降低电导率和MDA 的含量，提高POD、CAT 和SOD 酶活性［23］。本论文研究了在Pb 胁迫下。植物体内的这3种酶的含量变化进行了分析，结果表明SOD、POD 和CAT 3 种酶活性在重金属离子Pb 胁迫下均会显著降低，MDA 和O2-·含量显著增加；经过褐藻多酚提取物处理后，会显著提高3种抗氧化酶活性，减少MDA和O2-·含量，使其恢复到接近正常水平，从而降低了自由基对细胞膜的伤害。本研究发现，使用不同倍数的褐藻多酚处理，上海青体内Pb含量与稀释倍数成负相关，500～1 000倍稀释处理下，植株体内重金属铅的含量明显下降，并且增加了上海青的生物量，提高叶片SPAD 值，有效改善植株黄化。在Pb 胁迫下，施用褐藻多酚有利于缓解Pb 胁迫给上海青带来的伤害，减少重金属Pb 对作物带来的伤害。对于土壤重金属Pb 对作物的影响，有望通过使用褐藻多酚提取物来降低Pb 在作物体内的累积，提高农作物的安全性，但对其他金属作用是否起作用以及在不同作物、最佳使用量等还需进一步试验。