脊髓损伤后硫酸软骨素蛋白多糖及GFAP 表达的变化*

王国毓 程志坚 杨保辉 李浩鹏 贺西京

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种临床上常见的创伤，可导致终身残疾并给个人、家庭及社会都带来了巨大损失和负担[1]。近年来，随着现代交通等的发展，脊髓损伤的发病率呈逐年上升趋势[2]。目前，临床上脊髓损伤尚无有效的治疗策略。脊髓损伤后促进神经轴突和髓鞘的再生、改善神经元突起再生的微环境等方面是目前的研究热点。脊髓损伤后，星形胶质细胞向反应性星形胶质细胞活化并发生形态的剧烈变化，参与胶质瘢痕的形成[3]。

大多数学者认为，脊髓损伤后胶质瘢痕是阻碍轴突再生和功能恢复的主要原因之一，其中，胶质瘢痕中的反应性星形胶质细胞产生的硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycan，CSPGs）是主要的抑制性分子，而NG2、Neurocan 是主要的CSPGs 分子[4]。本研究采用脊髓横断法制作脊髓损伤的动物模型，观察脊髓损伤后NG2、Neurocan、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达的变化，从而探索脊髓损伤后轴突再生受到抑制的可能机理，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

SP 免疫组化染色试剂盒（北京中杉），兔抗大鼠GFAP抗体（武汉博士德），兔抗大鼠NG2 抗体（CHEMICON AB5320），小鼠抗大鼠NEUROCAN 单克隆抗体（CHEMICON MAB5212）。

1.2 实验动物及分组

SPF 级成年健康雌性SD 大鼠32 只，体重（205.68±9.88）g，由西安交通大学医学中心实验动物中心提供，动物质量合格证号: 陕医动字08005。应用随机数字表随机分为空白对照组（A 组）16 只和模型组（B 组）16 只。本研究实验方案经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准（批准号2018-2048），最大限度地降低实验动物痛苦，包括严格遵守实验动物处死步骤、合理脊髓损伤相关术后护理等。

1.3 脊髓横断模型的建立

脊髓损伤的动物模型采用脊髓横切法[5]: 3%水合氯醛腹腔麻醉（3 mL/kg）。麻醉成功后固定于操作台上，手术野剪毛备皮，碘酒消毒，酒精脱碘，取后正中切口（以T10 为中心）。逐层切开皮肤、皮下组织，切除T10 全椎板及T9、T11 部分椎板。对照组（A 组）对脊髓未作其他处理，局部应用明胶海绵止血。随后缝合切口。术后给予动物包括挤尿、抗感染、预防压疮等护理。模型组（B 组）显露硬膜囊，应用特制探针预置4 号丝线于脊髓腹侧硬膜外。用剃须刀片于预置线头侧0.5 mm 处将脊髓横断（相当T10水平），从腹侧向背侧提出预置线，确保脊髓完全横断，局部应用明胶海绵止血，逐层关闭伤口。

1.4 标本和组织切片的制作

标本的制作: 脊髓损伤术后3、7、14、28 d，每个时间段选4 只动物，麻醉满意后常规经心脏灌注后处死各组动物，完整取出脊髓全长行组织切片。

1.5 组织切片的NG2、Neurocan、GFAP 表达的检测

切片经脱蜡、水化，按照SP 试剂盒的说明书进行操作。显微镜下观察表达结果并在LeicaQ500IW 上进行图像采集，然后利用Image J 软件进行分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对本实验数据进行统计学处理。样本平均数、标准差和概率值分别以、 、表示。采用独立样本 检验进行两个均数比较＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脊髓损伤后NG2 表达情况

对照组（A 组）NG2 呈低表达。模型组（B 组）脊髓损伤后第3、7、14 及28 d 损伤部位NG2 表达均较对照组明显增高（均＜0.05，差异有统计学意义）。模型组脊髓损伤后3 d 后NG2 的表达开始显著升高，脊髓损伤后7 d 时NG2 的表达水平达到最高点，脊髓损伤后14 d 和28 d 时NG2 的表达继续维持在相对较高的水平，但比7 d 时的表达水平有下降（见图1）。

图1 脊髓损伤后NG2 表达情况: A.对照组和模型组（SCI 组）各个时间点NG2 免疫组织化学染色结果（×200）; B.NG2 表达统计学分析结果，对照组和模型组（SCI 组）3、7、14 及28 d 时间点的值分别为a、b、c、d，且均＜0.05

2.2 脊髓损伤后Neurocan 表达情况

在各时间点空白对照组Neurocan 均呈较低表达。在模型组中，Neurocan 在脊髓损伤后3 ～7 d 开始表达，主要在损伤部位，并于14 d 时达到峰值，但在28 d 时表达开始下降（见图2）。

图2 脊髓损伤后Neurocan 表达情况:A.对照组和SCI 组各个时间点Neurocan 免疫组织化学染色结果（×200）; B.Neurocan 表达统计学分析结果，对照组和模型组7、14 及28 d 时间点的值分别为a、b、c，且均＜0.05

2.3 脊髓损伤后GFAP 表达情况

在脊髓损伤后3、7、14 及28 d，模型组损伤部位GFAP的表达显著高于对照组，两组间比较差异有统计学意义（均＜0.05）。模型组脊髓损伤后3 d 后GFAP 的表达明显升高，GFAP 的表达在第14 d 达到峰值（见图3）。

图3 脊髓损伤后GFAP 表达情况: A.对照组和SCI 组各个时间点GFAP 免疫组织化学染色结果（×200）; B.GFAP 表达统计学分析结果，对照组和模型组3、7、14 及28 d 时间点值分别为a、b、c、d，且均＜0.05

3 讨论

近年来的研究表明，脊髓损伤发生后，反应性星形胶质细胞呈现GFAP 高表达，反应性星形胶质细胞的细胞形态呈现明显的肥大，并且增殖明显，随后形成胶质瘢痕并包围脊髓损伤的部位。星形胶质细胞产生4 种类型蛋白多糖: 乙酰硫酸蛋白多糖（HSPGs）、皮肤素硫酸蛋白多糖（DSPGs）、角质硫酸蛋白多糖（KSPGs）、硫酸软骨素蛋白多糖（CSPGs）。CSPGs 主要分布在脊髓损伤神经元周围，是最主要抑制性神经再生的物质[6]。CSPGs 由核心蛋白和一个或多个线性CS 通过共价连接而成，CSPGs 无论是在发育期间作为抑制性神经导向分子还是在成年期参与形成神经元周围网络的形成，其对神经生长及再生的抑制作用是明确的[7-8]。

CSPGs 广泛分布在中枢神经系统中，是神经系统细胞外基质成分中的蛋白多糖，包括一大类复杂的分子，根据硫酸软骨素（GAG 链）不同可分为5 种类型: NG2、aggrecan、brevican、Neurocan 和versican，其中NG2、Neurocan 是最主要的CSPGs 分子[9]。以NG2 的轴突抑制作用最强烈[10]。Neurocan 也是聚集蛋白聚糖家族中重要的CSPG 成员[11]，其一般通过与轴突蛋白-1、细胞黏附分子等大分子的相互作用，调节神经细胞间的连接，从而抑制轴突再生长。

CSPGs 是阻碍中枢神经损伤后神经再生化学屏障中主要成分，其主要通过CS 链导致向损伤部位延伸的轴突在胶质瘢痕处停止，造成生长锥塌陷[12-13]。目前初步了解CSPGs在脊髓损伤后表达的动态变化，脊髓损伤后4 d versican 表达显著增加，NG2、Neurocan 于2 周后达到峰值，brevican在2 个月内一直稳定表达，phosphacan 于脊髓损伤后立即减少，随后至原水平，并在2 个月后达到峰值[14]。原位杂交证明，脊髓损伤后所有的CSPGs 分子呈现高表达。对比脊髓损伤区域和正常区域的CSPGs 的表达水平，发现脊髓损伤后4 d，CSPGs 显著增加，脊髓损伤后40 d 时GFAP 与CSPG 一样在密度和空间上表达受限制[15]，此结果提示：CSPGs 可抑制脊髓损伤后轴突再生，目前认为其发挥作用的部位位于GAG 链[16]。本研究发现，与对照组比较，脊髓损伤后3、7、14 及28 d 损伤部位NG2 的表达明显升高（＜0.05）；脊髓损伤后3 ～7 d，Neurocan 表达显著增加，Neurocan 表达于14 d 时达到峰值，但28 d 时开始Neurocan的表达开始下降，与对照组比较（均＜0.05）; 脊髓损伤后3、7、14 及28 d 损伤部位GFAP 的表达升高，与对照组比较（均＜0.05），与上述研究结果一致。

游思维等[17]发现脊髓损伤后星形胶质细胞在中心区域的周围增生并形成网状结构，但其不足以形成阻碍神经纤维再生的机械性屏障。目前已经从胶质瘢痕中分离出CSPG 及其他多种抑制轴突生长的化学物质，这些化学物质形成的化学性屏障作用在脊髓损伤早期可能较机械性屏障有着更为强烈的阻碍神经轴突再生的作用。

近年来，已经将软骨素酶ABC 应用于脊髓损伤模型动物的治疗，并取得得了一定的疗效，软骨素酶ABC（ChSase）具有特异性消化CSPGs 的GAG 链，保留CSPGs 蛋白核心，但不降解其他ECM 内的蛋白多糖的作业。Bradbury 等[18]的研究发现软骨素酶ABC（ChSase）鞘内治疗可降解损伤部位的CS-GAG，上调受损神经元的再生相关蛋白，促进上行感觉投射和下行皮质脊髓束轴突的再生。软骨素酶ABC治疗还能在电刺激皮质脊髓神经元后恢复病变下方突触后活动，促进运动和本体感觉行为的功能恢复; Rosenzweig 等[19]回顾了软骨素酶ABC 治疗的证据，无论是作为一种单独的治疗或与其他策略相结合，在促进脊髓损伤后的修复方面可以有多种有益的效果。这些包括促进受损轴突的再生、未受损通路的可塑性以及对受损神经元的保护。更重要的是，ChABC 疗法已被证明可以促进脊髓损伤动物肢体功能的显著恢复。