口腔扁平苔藓实验模型建立的研究进展

沈晨露 叶伟佳 吕柯佳 高碧聪 姚华

浙江大学医学院附属第一医院口腔科 杭州 310003

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是一种口腔黏膜慢性炎症性疾病，临床表现多样[1]，常累及颊部、舌背、牙龈等部位[2]，多为双侧、具有对称性，病理特征表现为上皮下淋巴细胞呈带状浸润和基底细胞液化变性[3]。OLP在普通人群中的患病率在0.5%到2.2%之间，好发于30～70岁人群，且女性更易患病[4-6]，因其慢性的疾病进展、潜在的恶变可能[7-8]及难以自愈等特征，给患者身心健康带来严重影响。目前临床上尚没有OLP有效的根治措施，常使用糖皮质激素和免疫调节药物来缓解疾病发展，停留在将疾病控制稳定防止癌变阶段。为探寻治疗OLP的方法，建立理想的OLP实验模型进行研究非常必要。但临床上OLP特征常与其他口腔黏膜疾病特征重叠在一起，且OLP不具有无限增殖的特点，在实验模型中疾病特征往往随时间延长而消失，为OLP的研究带来较大的困难。目前为止，国内外学者尚未建立完善的OLP动物模型，但仍有不少学者进行了初步的探索，细胞模型则相对成熟。因此，本文将对目前已开展的OLP实验模型进行综述。

1 与OLP相关的实验模型研究现状

1.1 OLP细胞模型研究现状

1.1.1 人OLP角质形成细胞的体外培养 有学者[9]从组织病理学确诊的OLP患者黏膜组织分离上皮层，酶解消化并于无血清角化细胞培养基中进行体外原代及传代培养，成功建立了体外培养人OLP角质形成细胞的方法。后有学者[5,10]重复了该实验，也成功培养出了体外OLP角质形成细胞，且可成功传代5～6代而不丧失活力。该建模方法采用直接提取病变组织进行培养，保证了培养细胞的代表性，但细胞传代次数较少，不能模拟OLP的慢性疾病过程，尤其是无法建成为具备黏膜特征的模型。

1.1.2 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激人口腔角质形成细胞（human oral keratinocyte，HOK）/人永生化角质形成细胞（human immortalized keratinocyte，HaCaT） 目前大量OLP细胞因子相关研究都使用革兰氏阴性菌LPS刺激HOK的炎症模型来进行研究。使用LPS作为诱导炎症因子的介质，来研究OLP炎症细胞因子的变化[11-12]。此外，HaCaT是人类皮肤角质形成细胞的永生细胞[13]，因其容易生长和无限传代的特点，是口腔角质形成细胞的合适替代品。有学者选取HaCaT作为研究对象，将HaCaT在无血清的培养基中饥饿24 h，再在无血清环境下用不同浓度从大肠埃希菌055:B5中净化出的LPS处理，来介导模拟局部OLP免疫环境。该细胞模型建立方法被应用到后期多个实验[14-16]中。但LPS处理HOK/HaCaT结果不定向，模拟环境可能与OLP免疫环境存在差异。

1.1.3 角质形成细胞/T细胞共培养模型 OLP免疫学机制相关的关键细胞主要为角质形成细胞和T细胞，因此有学者选用这两者共培养进行OLP细胞模型的建立。基于OLP发生的首要原因是激活诱导自身反应性T细胞产生的抗原、超抗原，该学者[17]采用干扰素（interferon，IFN）-γ刺激纯化培养的角质形成细胞作为非专职的抗原递呈细胞，将原代培养的T细胞作为免疫细胞，来模拟OLP病损的免疫应答环境，并将亚适剂量的植物血凝素类多克隆刺激剂（phytohaemagglutinin，PHA）作为抗原刺激物，来推测OLP患者体内特异性免疫应答的状况[18-19]。结果发现该共培养模型能在一定程度上模拟OLP局部损害的免疫应答环境，虽然可能与机体OLP局部免疫环境存在一定的差异，但具有一定代表性。

1.2 OLP动物模型研究现状

1.2.1 移植法 参考口腔癌动物模型中的移植瘤模型[20]，有学者[21]提出通过移植OLP组织块来进行OLP动物模型的建立。早期研究[21]选取裸鼠作为实验对象，将OLP病变组织移植至裸鼠皮下，但随后发现其病理学特征迅速消失。这可能是因为裸鼠虽然缺失细胞免疫系统，但仍保留了比较完整的体液免疫系统，从而导致裸鼠对病变组织的排斥。基于该研究，随后有学者[22]选取了先天缺乏功能性T、B细胞的严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠作为实验对象，采用将患者非糜烂型OLP病损移植到SCID小鼠的舌腹和背部，并于移植术后第1、2周取出移植物进行病理学检查，但是移植物的病理学特征仍逐渐消失。这一方面可能是因为SCID小鼠体内仍存有大量自然杀伤细胞，另一方面可能是因为移植物大小被小鼠体型限制，导致淋巴细胞和细胞因子数量偏少，从而丧失病理学特征。

1.2.2 局部注射法及针刺划痕法 董鑫[23]采用不同浓度的OLP组织匀浆进行口腔黏膜下及背部皮肤皮下局部注射，4周后病理结果发现黏膜下层有慢性炎细胞浸润，但上皮层与固有层均未见明显变化。这说明仅皮下注射无法引起上皮及固有层的炎症。基于局部注射法的缺陷，胡维力[24]采用针刺法建立OLP模型，同样取OLP患者病变组织制成匀浆，再用装有匀浆的注射器垂直小鼠口腔黏膜反复刺入、拔出直至针刺部位黏膜表面充血，再在黏膜下注入少许组织匀浆，4周后处死小鼠取病变组织制成病理切片。但病理结果仍未出现典型的OLP固有层淋巴细胞浸润带，这一方面可能是因为OLP不具有无限增殖能力，不能在动物体内广泛增殖，另一方面可能因为实验动物体内仍存在免疫反应。

1.2.3 免疫缺陷小鼠注射人外周血淋巴细胞构建模型法 由于OLP是T细胞介导的黏膜疾病，胡维力[24]尝试通过给非肥胖糖尿病严重联合免疫缺陷（non-obese diabetes/severe combined immunodeficiency，NOD/SCID）小鼠腹腔注入人外周血淋巴细胞（human peripheral blood lymphocyte，Hu-PBL）来建立具有人免疫学特性的非肥胖糖尿病严重联合免疫缺陷（human peripheral blood lympho cyte non-obese diabetes/severe combined immunodeficiency，Hu-PBL-NOD/SCID）小鼠模型，以确保T细胞的聚集，从而快速建立起OLP动物模型。但以失败告终，该学者发现如果PBL注射数量不足，就难以建立起有效的免疫系统；但PBL注射数量过大，又容易发生移植物抗宿主反应（graft versus host reaction，GVHR）。

2 靶向OLP发病原因和机制的动物模型构建

经过学者们大量的研究，OLP实验模型取得了一些可喜的进展，然而，迄今为止，国内外尚无理想的模型开展OLP诊治的体内外模型研究。深入探讨建立OLP模型将有助于OLP病因学、诊治学的研究。

2.1 以病因为基础构建OLP模型研究趋势

迄今为止，OLP的病因尚未明确，遗传易感性、免疫机制、心理疾病、药物过敏反应和感染等都是与OLP相关的病因因素[25-27]。目前将OLP可能病因主要分为4种：局部或系统因素引起的细胞介导超敏反应、压力、病毒感染、上皮抗原自身免疫反应与外部抗原失调反应[27]。其中尚无确切证据证明OLP与过敏反应、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染有直接关系。

压力被认为在OLP发病过程中起着重要作用，据报道，与正常对照组相比，OLP患者更容易出现焦虑和抑郁。急性和慢性心理压力可以诱导先天性和适应性免疫反应的显著变化，这些免疫反应变化主要通过下丘脑-垂体-肾上腺轴和交感神经-肾上腺轴的神经内分泌介质介导[28]。但心理压力在实验室中较难定义和模拟，因此不推荐单独使用该病因作为未来OLP动物模型构建方向，可以作为辅助因素作为模型研究对象。

因此，目前来看，自身免疫反应支持患者自身T细胞杀死自体角质细胞的理论应是未来OLP模型构建的主要趋势，可以尝试通过诱导实验体自身免疫反应来进行实验模型的设计，以此探索OLP的致病因素，起到早期预防OLP发生的作用。

2.2 以机制为基础构建OLP模型

免疫介导细胞凋亡有多重机制，但目前OLP角化细胞凋亡的机制仍不明确。在角质形成细胞/T细胞共培养模型成功的基础上，未来研究可以重点探索T细胞活化上游反应机制。导致T细胞活化或耐受的专职抗原呈递T细胞主要依赖于树突状细胞（dendritic cell，DC），有研究[29]发现OLP病损中存在DC、T细胞交互反应引起T细胞活化。OLP的DC亚群主要包括上皮层中的朗格汉斯细胞、固有层/间充质中的髓样DC以及浆细胞样DC。成熟DC表达T细胞活化所需要的全部分子，主要存在于固有层，并与T细胞成簇分布[30]；浆细胞样DC主要产生IFN-α，有研究显示IFN-α是另一种通过诱导黏病毒抗性蛋白A（my xo virus resistance protein A，MxA）和其他基因表达刺激Ⅰ型免疫反应的细胞因子[31-32]，可以启动自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）/T细胞的杀伤作用或者Fas L介导的细胞凋亡[33]。

一方面，虽然引起CD4+T细胞和CD8+T细胞反应的抗原是未知的，但可以尝试使用IFN-α来诱导OLP角化细胞凋亡，探索OLP致病过程的其他通路，有助于OLP的病理机制研究及靶向药物开发。另一方面，DC作为抗原提呈细胞，诱导了特异性的适应性免疫发生[34]，对DC的研究将有利于探索OLP炎症发生的始动因素, 为OLP预防治疗提供理论依据和参考。

3 小结

综上所述，目前OLP细胞模型已较为成熟，并且多数已经过反复验证，这为OLP病理机制尤其是特异性免疫应答有关的研究提供了基础。但国内外尚未建立完善的OLP动物模型，目前的OLP动物模型可以形成固有层散在淋巴细胞浸润等慢性炎症的病理表现，但还未出现典型的淋巴浸润带，相对来说更接近于口腔苔藓样变的病理表现[20,35]，其主要难点在于：一是OLP特异性发病机制的复杂性；二是OLP不具有无限增殖的能力，无法在动物实验模型中长期存在。未来的研究可以着眼于实验动物的选择、有效抗原的提取及IFN-α与IFN-γ诱导等方面入手，进一步探索OLP动物模型的建立。