哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1介导的自噬对骨代谢的调控

朱俊瑾 周佳琦 伍颖颖

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医学院 成都 610041；2.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院种植科 成都 610041

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物（mammalian target of rapamycin complex， mTORC）1是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）形成的一种复合物，能整合多种细胞内外信号，进行蛋白质、脂质合成和自噬调控。其中，自噬是细胞降解损坏的蛋白质或细胞器并将其循环利用的过程，对于维持细胞寿命具有重要生理意义。近年来，对mTORC1介导的自噬效应关注增多，对mTORC1介导的自噬效应在骨组织调控方面的研究也不断深入。本文就mTORC1/自噬通路在成骨细胞及破骨细胞分化、功能活性等方面的作用进行综述，为骨代谢的生物学机制及骨相关疾病研究提供新思路。

1 mTORC1

mTOR可整合多种信号，在适当条件下直接激活丝氨酸/苏氨酸激酶，促进细胞生长、增殖。在结构及功能方面，mTOR与其他蛋白质分子构成两种不同复合物，分别为mTORC1和mTORC2，其核心组分分别为Raptor和Rictor。由于雷帕霉素的短期应用不会干扰mTORC2信号，一般认为mTORC2对雷帕霉素不敏感，因此在进行mTOR的研究中，关注点多集中在mTORC1。

mTORC1能整合多种细胞内外信号（如生长因子、氨基酸、应激、氧、能量），通过关键的上游调节因子结节性硬化（tuberous sclerosis，TSC）1/2复合物，一种针对三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）酶Rheb的GTP酶活化蛋白，可将Rheb从GTP结合的激活态转变为二磷酸鸟苷（guanosine diphosphate，GDP）结合的失活态，负性调节mTORC1。TSC1/2的这种作用使其在mTORC1的上游通路中承担信号传递的工作。细胞外信号如胰岛素/胰岛素样生长因子（insulinlike growth factor，IGF）-1，通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和Ras通路刺激蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）、细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular-signalregulated kinase，ERK）1/2等效应激酶，使TSC1/TSC2磷酸化，致其失活，从而激活mTORC1，并对下游靶点进行调节[1-2]。

mTORC1完成信号整合后，调控蛋白质合成、脂质合成、自噬等重要的细胞活动。mTORC1对蛋白质合成调控主要通过mTORC1靶蛋白核糖体蛋白S6激酶（S6 kinase，S6K）1和真核起始因子4E结合蛋白（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein，4EBP）1的磷酸化，而脂质合成则由mTORC1激活胆固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding protein，SREBP）1/2引起[3]。在自噬方面，mTORC1抑制转录因子（transcription factor，TF）EB的细胞核内转移和活性，在一定程度上抑制自噬活动[4]。

2 自噬

自噬是细胞吞噬过量或有缺陷的细胞器，在溶酶体中将其降解为最基本的允许循环利用的小分子，以实现细胞自我更新的生理过程。根据被降解的底物进入溶酶体方式的不同，自噬分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。研究较多的为巨自噬，简称自噬。当自噬发生时，细胞内双层隔离膜包裹待降解的细胞器，形成密闭的自噬体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，并将自噬体的内囊泡释放到囊腔中，在水解酶的作用下分解为小分子，供细胞循环利用。如果细胞发生自噬缺陷，可能引起多种疾病发生，如肿瘤、自身炎症性疾病[5]、风湿性疾病等[6]。

在形成自噬体的过程中，自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）发挥了重要的调控作用[7]，ATG蛋白参与自噬体的形成、吞噬泡的伸长以及介导自噬体与溶酶体的结合。大多数核心ATG蛋白被募集到自噬体的形成位点，即吞噬泡装配位点（phagophore assembly site），促进自噬体形成。在这一过程中，哺乳动物ATG1蛋白家族中UNC-51样激酶（Unc-51-like kinase，ULK）1、ULK2，以及mATG13，与粘着斑激酶家族相互作用蛋白（focal adhesion kinase family interacting protein，FIP）200形成复合物，同样参与自噬体在吞噬泡装配位点的起始调节。此外，启动自噬还需要PI3K/Vps34复合物Ⅰ的参与。吞噬泡的伸长延伸过程则涉及ATG12和ATG8（LC3）两种重要的泛素样蛋白。脂质形式的LC3（LC3-Ⅱ）还能附着于自噬体的双层膜上，介导自噬体与溶酶体的融合。

3 mTORC1调控的自噬对骨代谢的调节

3.1 mTORC1在自噬中的调控机制

mTORC1在自噬中起着重要的调节作用。mTORC1对自噬的调节涉及ULK1复合体的参与。ULK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在自噬诱导早期起着关键作用。在营养丰富的条件下，mTORC1结合到ULK1复合物中，随后磷酸化ULK1和ATG13，抑制自噬活性；而在营养缺乏状况下，mTORC1从与ULK1复合物的结合中分离出来，导致ULK1去磷酸化及活性增加，而后磷酸化ATG13和FIP200，启动自噬体的形成，介导自噬发生[8]。当自噬溶酶体内的吞噬物被水解酶降解，产生的氨基酸可将固定在溶酶体上的RagA/B GDP-RagC/D GTP异二聚体转化为RagA/B GTP-RagC/D GDP的形式，介导了mTORC1的Raptor亚基与Rag-Ragulator复合体的结合，从而抑制自噬。另外，p62蛋白（又称SQSTM1蛋白）是一种选择性自噬接头蛋白，也参与自噬的稳态调节过程。p62和Rag GTP酶形成的特殊复合物也可将mTORC1吸附至溶酶体表面，并响应氨基酸信号，促进RagA/B GTP-RagC/D GDP的形成[9]。而mTORC1被p62激活后，又磷酸化其底物S6K1和eIF4E结合蛋白，从而抑制自噬发生相关蛋白，负向调控自噬。

3.2 mTORC1/自噬参与对骨代谢的调控

mTORC1介导的自噬效应在骨代谢过程中起重要的调节作用。骨代谢为骨相关细胞的代谢活动，参与代谢的细胞主要有成骨细胞（osteoblast）、破骨细胞（osteoclast）、骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cell）以及骨细胞等，其中成骨细胞和破骨细胞分别通过形成新骨和吸收旧骨，使骨组织处于动态平衡中[10]。多数研究表明，mTORC1受雷帕霉素抑制后，骨组织中的自噬水平提高，改善了骨代谢。

3.2.1 mTORC1正向调节成骨细胞成骨向分化 骨髓间充质干细胞作为成骨细胞和脂肪细胞的前体，负责骨的形成、生长和发育[11]。成骨细胞受损以及脂肪生成增加可能引起骨稳态失衡，导致骨量减少，骨髓脂肪堆积，最终导致骨质疏松症[12]。而通过成骨细胞特异性敲除或雷帕霉素治疗以阻断mTOR信号传导，可以改善成骨分化并抑制骨髓间充质干细胞的脂肪细胞向分化来逆转肌原纤维蛋白1缺陷小鼠的骨质减少表型[13]。体内实验[14]揭示，雷帕霉素通过提高骨髓间充质干细胞自噬水平，能够改善卵巢切除术后小鼠骨髓间充质干细胞功能，提高细胞再生能力，部分恢复小鼠低骨量表型，在一定程度上抑制骨质疏松。进一步的体外实验[15-16]表明，在成骨细胞中应用雷帕霉素抑制mTORC1后，细胞自噬水平提高，同时成骨活性也增加，促进了骨形成。

自噬环节受到抑制会影响成骨。Piemontese等[17]发现，在小鼠成骨细胞中条件性敲除编码自噬相关蛋白ATG7的基因后，细胞成骨活性下降，小鼠股骨、脊椎和总体骨密度降低，增加了骨折发生。同时，成骨细胞自噬功能受抑制还会影响骨细胞的形态和功能，细胞核呈圆形并偏离中心，而这种破坏可导致骨量和结构受影响，从而降低骨强度。研究[18]发现，自噬在成骨细胞生长、分化过程中并不呈现同一水平。在成骨细胞汇聚成团、形成结节阶段，自噬水平明显高于细胞增殖和分化早期，抑制该时期特殊蛋白FIP200会导致成骨细胞分化末期受到抑制，使小鼠骨骼发育受到损害。

mTORC1/自噬通路参与一些常见信号分子对骨的调控。一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）可通过早期mTOR抑制介导的自噬和后期AKT/mTOR信号轴的晚期激活来调控人牙髓间充质干细胞的成骨分化[19]。而PI3K/AKT/mTOR信号级联可以通过高剂量慢性饮酒来激活。同时在小鼠模型中观察到成骨分化减少，骨髓间充质干细胞脂肪细胞向分化加强和骨质减少[20]。同样，当体内外成骨细胞发生自噬缺陷时，细胞成骨能力和矿化水平均降低，这可能由成骨细胞中自噬泡运输过程被阻断引起的矿化减少所致[21]。

相反，也有观点认为，mTORC1抑制介导的自噬激活并不利于骨量调节，抑制自噬反而可能促进成骨分化[22]。Fitter等[23]建立前成骨细胞特异性Raptor基因敲除小鼠模型，通过体内外实验证明废除mTORC1功能导致成骨潜能下降，表现为低骨量的成骨表型。这可能与mTORC1在生物形成中的基础作用有关。mTORC1参与转录和翻译等过程，调控蛋白质的形成[24]。当敲除Raptor基因后，mTORC1无法为细胞分化提供必需蛋白质，从而阻断前成骨细胞的成骨分化过程。

3.2.2 mTORC1/自噬对破骨细胞可能存在双向调控 破骨细胞功能也受到mTORC1/自噬的调控[25]。在高糖（30.5 mmol·L-1）环境中，RAW264.7细胞中AMPK的磷酸化水平下降，促进了mTOR磷酸化，致使ULK1磷酸化水平降低，进一步引起LC3Ⅱ含量下降，抑制破骨发生。雷帕霉素处理提高了细胞自噬水平，破骨细胞数目也随之增多[26]。另外，抑制自噬还可能会废除它对肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptorassociated factor，TRAF）3的降解作用，延迟破骨细胞在体内外成熟[27]。TRAF3是一种阻止破骨分化的细胞内因子，在自噬过程中被溶酶体降解。当自噬受抑制后，TRAF3降解过程中断，不利于破骨细胞分化。

然而，有研究表明自噬激活反而会对破骨细胞产生负性调节作用。核因子κB受体活化因子配体（nuclear factor κB receptor activator ligand，RANKL）/核因子κB受体活化因子（nuclear factor κB receptor activator，RANK）途径对于破骨分化至关重要。成骨细胞上RANKL通过与破骨细胞前体上的RANK结合介导骨吸收，此过程可被骨保护素（osteoprotegerin）抑制[28]。据报道[29]，骨保护素通过磷酸化AMPK，促进TSC1/2复合物的形成，其下游mTORC1接受信号后抑制Rheb表达，促进自噬，然而却抑制破骨细胞分化及破骨吸收活性，且雷帕霉素的应用导致破骨细胞数目进一步下降。在Raptor缺陷型骨髓来源的巨噬细胞的调节相关蛋白质中，观察到较低的mTORC1信号传导和延迟的破骨细胞分化，而组成性激活的S6K1可避免破骨细胞受损，促其分化。当进一步使用雷帕霉素抑制S6K1后，又抑制了破骨细胞特异性基因表达[30]。另外，在对人类骨相关疾病的研究中，破骨细胞被认为是畸形性骨炎（Paget’s disease of bone）的关键细胞，过度的骨吸收导致畸形性骨炎患者局灶性和无序性骨转换增加[31]。在畸形性骨炎患者的破骨细胞中，mTORC1的表达水平高于正常对照组，同时细胞存在自噬缺陷，包括自噬体形成受抑制和自噬清除缺陷。而3-磷酸肌醇依赖蛋白激酶（3-phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK）1可通过mTORC1/自噬调节作用，部分影响破骨细胞表型。当抑制畸形性骨炎患者破骨细胞的PDK1后，mTORC1的表达降低，细胞表现出更高的LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值，骨吸收能力受抑制[32]。这进一步强调了mTORC1/自噬通路在维持骨稳态中的重要作用，mTORC1/自噬通路作为调节破骨分化和骨吸收的双刃剑，可能是骨相关疾病的治疗靶点。

3.2.3 mTORC1/自噬对骨细胞的调控尚未明确 目前，关于mTORC1/自噬在调节骨细胞稳态中作用的研究仍然有限。之前研究[33]表明，mTORC1信号传导可能参与骨细胞间的细胞通讯，间隙连接蛋白connexin（Cx）43是一种主要的半通道蛋白，可维持相邻骨细胞间的树突状连接和骨稳态。地塞米松抑制AKT-mTORC1信号会导致Cx43的降解[34]。在自噬激活后，Cx43被内吞到自噬溶酶体中并通过自噬降解，导致树突状连接缩短且树突连接减少，损害了骨细胞间的细胞通讯。

有趣的是，mTORC1/自噬在骨细胞中的作用也有相反的研究报道[35]，抑制骨细胞的自噬功能可能会引起细胞的低骨量表型。而使用雷帕霉素至少部分通过激活骨细胞的自噬来降低老年雄性大鼠骨小梁衰退程度，表明雷帕霉素可能是老年骨质疏松症的可行治疗药物[36]，但关于mTORC1/自噬信号与骨细胞稳态间的关系还需进一步的研究。

4 小结

mTORC1介导的自噬作用通过对各种骨相关细胞（如成骨细胞、破骨细胞、骨细胞）的活性、功能进行调控，影响骨代谢过程，其中涉及多种信号分子的调节，在骨组织代谢过程中起到重要作用。mTORC1或自噬的任一环节发生异常，都可能引起细胞活性、功能异常并导致疾病的发生。应用抑制剂（如雷帕霉素）或调控内源性信号分子能够抑制mTORC1，从而提高自噬在骨组织中的水平。然而，目前研究显示mTORC1抑制引起的自噬水平提高并不完全有利于骨量调节，这可能与不同研究中mTORC1的抑制水平和自噬活化水平区别较大有关，接近极值的水平可能会影响细胞的基础功能，从而呈现相反结果，且细胞生长、分化不同阶段的自噬水平也不一致。不同细胞间的研究结果表明了mTORC1/自噬信号网络的复杂性，进一步深入探究mTORC1/自噬信号及其上下游转录因子的系列分子事件尤为重要，其结果有望为人类骨疾病的治疗和预防提供新思路。