表皮生长因子受体与肿瘤分子成像研究进展

洪雅敏 涂蓉* 尤晓光

随着肿瘤靶向治疗药物在临床应用的日趋成熟和不断发展，分子病理学中的靶分子诊断技术得到了长足进步，也给活体分子成像带来了机遇与挑战。通过合成靶向对比剂对肿瘤进行活体靶分子诊断已经成为目前的研究热点和难点，分子成像有望通过医学成像的方法直接或间接地在分子水平对活体生理和病理情况进行动态、实时成像。分子成像主要由对比剂和靶分子两部分组成，针对不同类型的肿瘤，选择特异性高表达的靶分子对选择和构建对比剂具有重要意义。目前较常见的靶分子有表皮生长因子受体 （epidermal growth factor receptor，EGFR）、血管内皮生长因子受体、整合素αvβ3受体、生长抑素受体、转铁蛋白受体、叶酸受体等，其中EGFR在许多上皮组织中表达，在人类所有癌症中约有三分之二过表达，是理想的抗肿瘤治疗和成像的靶分子。以EGFR作为靶分子的分子成像方法包括 CT、MRI、正电子发射体层成像（PET）、单光子发射体层成像（SPECT）、荧光成像、超声成像及光声成像等，本文就上述成像方法在肿瘤研究中的特点、价值和发展前景进行综述。

1 EGFR的特性

人表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor，HER）家族为Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，包括EGFR/ErbB1/HER1、HER2/ErbB2/c-neu、HER3/ErbB3和 HER4/ErbB4共 4种受体，EGFR是HER家族成员之一。EGFR对细胞的生长增殖和分化起着重要作用[1]，可在人类许多上皮起源的恶性肿瘤中发生突变或过度表达，主要存在于非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）、 胶质母细胞瘤，也可见于卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌、食管癌、膀胱癌、胰腺癌及肾癌。由于EGFR水平与病人预后有关，临床上常将EGFR作为靶分子进行抗肿瘤药物治疗。

2 EGFR的分子成像

EGFR是大小为170 ku的跨膜糖蛋白，广泛存在于不同肿瘤表面。针对EGFR的治疗药物在临床上已有应用，如西妥昔单抗、帕尼单抗和耐昔妥珠单抗已经是美国食品药物监督管理局（food and drug administration，FDA）批准的EGFR单克隆抗体。耐昔妥珠单抗和帕尼单抗用于治疗非小细胞肺癌和转移性结直肠癌，西妥昔单抗用于头颈部癌和结直肠癌。由于并非所有肿瘤都有EGFR高表达，因此筛选其高表达的肿瘤是治疗的关键。EGFR分子成像时需先找到特异性靶向EGFR的转运载体，并设法使其成像，才能实现临床应用。目前已用于与EGFR相结合进行成像的转运载体包括表皮生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF）、EGFR 单克隆抗体（如西妥昔单抗、帕尼单抗等）及抗体片段[如F(ab’)2]、蛋白结构域（如Gp2结构域）和GE11多肽[2]等。现针对以EGFR为靶分子的不同成像方法予以介绍。

2.1 MRI MR分子成像依靠靶向对比剂增强扫描，目前可用于MR分子成像的对比剂主要有钆剂（如Gd-DTPA）、超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide，SPIO）、硒和锰[3]。 尽管已有研究[4-6]表明，应用Gd-DTPA偶联EGFR-iRGD蛋白合成的对比剂较传统对比剂对EGFR高表达人胃癌细胞（BGC-823）有更好的肿瘤靶向成像能力，且没有明显的细胞毒性；但由于游离Gd具有毒性，制备含Gd分子对比剂需要对游离Gd进行包裹，合成难度较大且价格昂贵，因此SPIO是目前分子对比剂研究的主要方向。一些SPIO成像的研究[7-8]结果均显示注射对比剂后肿瘤区在T2WI上呈更低信号 （SPIO为阴性对比剂，强化越明显，T2WI信号越低），表明SPIO用于分子成像的可行性。铁剂很容易被肝脏的网状内皮细胞吞噬及非特异性结合，会使肿瘤背景比降低，为了提高肿瘤背景比，Chen等[9]研究发现脂质体包裹氧化铁纳米颗粒表面可以有效减少体内目标细胞非特异性结合，并可防止纳米颗粒沉降。Colecchia等[10]对小鼠HNSCC肿瘤模型注射EGFFe纳米颗粒，Fe纳米颗粒经腹膜注射比经静脉注射能够更快地在肿瘤积累，强化速度更快。分子靶向对比剂除可单独用于诊断外，也可用于诊断治疗一体化，Tseng等[11]将超顺磁性氧化铁纳米颗粒（由高碘酸氧化与葡聚糖包被）与西妥昔单抗结合制备纳米颗粒，将其用于EGFR过表达的细胞系A431和32D/EGFR，能够比单独用西妥昔单抗检测到更多的凋亡细胞。Liao等[12]应用载有多柔比星和SPIO的西妥昔单抗免疫胶束靶向EGFR过表达的肿瘤细胞，结果发现其比非靶向对照组更能有效抑制细胞增殖，表明该对比剂具有使肿瘤细胞成像和治疗肿瘤的双重作用。总之，MR靶向对比剂在肿瘤靶分子的定量诊断和诊治一体化方面具有研究前景，但成像敏感性不及核医学成像。

2.2 PET及SPECT PET能够反映病变的分子、代谢及功能状态，已有利用各种放射性核素（包括124I、64Cu、89Zr和86Y等）标记西妥昔单抗进行分子成像的实验与临床研究。Krüwel等[13]建立了原位人乳腺癌MDA-MB-468、MDA-MB-231及皮下人表皮样癌A431小鼠模型，使用99Tcm标记的EGFR纳米抗体在3种小鼠肿瘤模型中观察小肿瘤（＜100 mm3）病变，给药后45 min肿瘤即可显像，其中MDA-MB-468和A431肿瘤均呈高摄取，MDA-MB-231肿瘤未见明显摄取，表明对比剂对较小肿瘤早期显像有一定的特异性和敏感性，有望用于改善肿瘤病人的预后。有研究者[14]合成EGFR靶向对比剂89Zr-西妥昔单抗来评估能否区分对西妥昔单抗治疗有无应答的结直肠癌病人，结果显示10例直肠癌病人中有6例肿瘤病变显示摄取，其中4例病人的摄取具有临床意义。van Dijk等[15]研究发现，对HNSCC病人进行PET可以监测肿瘤治疗效果。除化疗外，放射免疫疗法也是靶向治疗EGFR阳性肿瘤的有效方法。Song等[16]研究食管鳞状细胞癌模型中64Cu-/177Lu-西妥昔单抗的免疫PET和放射免疫治疗疗效，结果表明64Cu-西妥昔单抗免疫PET可以显示食管鳞状细胞癌肿瘤中EGFR的表达水平和治疗效果。

SPECT可同时对多个对比剂进行成像，但其敏感性不及PET。常用于标记西妥昔单抗的放射性核素多为111In、188Re、177Lu 等。 van Dijk 等[17]使用111In-西妥昔单抗-F（ab’）2对HNSCC小鼠进行成像的结果显示，相比使用111In-西妥昔单抗，其在24 h时具有更高的肿瘤背景对比（69.7±3.9和107.0±17.0）。有研究[18-19]表明188Re-西妥昔单抗是EGFR阳性肿瘤的潜在靶向对比剂及治疗剂，通过小动物SPECT/CT评估188Re-西妥昔单抗在荷人肺癌NCI-H292小鼠中有肿瘤靶向和抗肿瘤作用。

总之，核医学成像是最早用于肿瘤分子靶向成像研究的技术，在肿瘤分子靶标的定量诊断，特别是诊治一体化方面有良好的研究与临床应用前景，但因检查费用高限制了其临床应用。

2.3 荧光成像 荧光成像是用于表浅部位病变的一种成像技术，荧光物质合成方便是其主要优点。目前用于研究EGFR分子靶向荧光成像的荧光物质有水溶性荧光染料、荧光量子点、荧光有机纳米粒子、两性离子近红外荧光团等。荧光成像敏感性高，检查过程无创且经济，但空间分辨力较差并受限于兴趣区的组织深度。为避免人体组织的自发荧光造成的背景信号过高，Ryu等[20]将近红外荧光团（Cy5.5）和黑洞淬灭剂（black hole quencher-3，BHQ-3）依次缀合至EGF制备成自淬灭的EGF纳米颗粒，可以减少乳腺癌肿瘤模型背景信号并增强荧光强度。荧光成像除了用于单纯肿瘤诊断外，也可用于治疗，Kim等[21]将抗EGFR适配体耦合量子点（诊断）和抗癌小干扰RNAs（治疗）用于三阴性乳腺癌小鼠模型的诊断和治疗，与非靶向对照组相比，实验组显示更有效的基因沉默和肿瘤信号增强。荧光成像也可借助于内镜诊断体内脏器病变，Liu等[22]将荧光缀合物AF488标记西妥昔单抗合成荧光靶向对比剂，在结直肠肿瘤病人中通过共聚焦激光内镜成像，对37个肿瘤病灶进行体内EGFR染色后，在癌（94.7%）和腺瘤（66.7%）的成像中可见特异性荧光信号和EGFR积聚，表明通过内镜进行荧光分子成像对术中精确定位病变组织具有一定的临床应用潜力。荧光成像多用于表浅空腔脏器，但也可用于术中对实质性脏器肿瘤的显示，Tummers等[23]对接受胰导管腺癌手术切除的病人进行评估，使用西妥昔单抗-IRDye800进行肿瘤靶向荧光成像及光声成像，结果显示肿瘤的平均荧光强度（0.09±0.06）明显高于周围正常胰腺组织（0.02±0.01）和胰腺炎组织（0.04±0.01），肿瘤部位的平均光声信号高于周围组织3.7倍，表明在人体中使用荧光成像进行术中检测具有安全性和可行性，对外科医生识别肿瘤边界有重要意义。总之，荧光成像对表浅肿瘤和空腔脏器肿瘤的成像，以及术中显示肿瘤边界具有良好的应用前景，但对深部实质性脏器肿瘤难以显示，且很多荧光物质不能用于体内，故其临床应用受到限制。

2.4 超声与光声成像 超声分子成像通过分子靶向微泡对比剂在体内进行超声成像。靶向EGFR的单纯超声分子成像研究较少，Knowles等[24]研究表明西妥昔单抗标记的超声微泡对EGFR高表达HNSCC裸鼠进行超声成像具有可行性，注射靶向微泡对比剂的肿瘤内回声明显高于对照组微泡对比剂（IgG）。由于超声成像获得的信息量十分有限，所以目前的研究多集中于超声引导的光声成像（photoacoustic imaging，PAI）。 PAI比常规超声成像的影像分辨力更高，且比荧光成像检测组织的深度更深及更高的空间分辨率，产生超声信号的脉冲激光在安全水平时，PAI检测组织深度可达5～6 cm，而普通光学成像的检测深度在5 mm左右[25-26]。常用的光声成像对比剂包括金纳米棒和纳米球、二氧化硅包覆的金纳米棒和银纳米片，纳米颗粒的生物安全性尚未得到验证，还有待广泛的测试和临床前试验。现已有亚甲蓝、吲哚菁绿等近红外荧光染料经FDA批准用于实验研究，如Sano等[26]使用吲哚菁绿标记的帕尼单抗对乳腺癌小鼠进行体内外成像，体外PAI结果显示在EGFR高表达A431和MDAMB-468细胞中的光声信号强度较对照细胞分别增加109%和62%，体内PAI显示对比A431荷瘤小鼠静脉注射对比剂前后的光声信号影像，注射后的肿瘤光声信号强度增加了114%。有研究[27]表明EGFR靶向PAI可以对人类三阴性乳腺癌小鼠模型中的原发性肿瘤和转移性淋巴结成像，可以早期显示已迁移至区域性淋巴结内的乳腺癌细胞。PAI目前在临床应用中的主要不足是成像穿透的组织深度有限，易受背景信号干扰，可以通过使用内镜检查和交替波长来最大限度地减少背景信号。总之，超声成像具有简便性和普及性优势，为EGFR肿瘤成像的临床应用奠定了基础，但其影像分辨力仍显不足，还需要进行大量的深入研究。

2.5 CT 含碘化合物是CT的常用对比剂，但由于其循环时间短且有潜在的肾毒性，目前研究了一些高原子序数的金属元素，且已被证明具有更长的循环寿命和可接受的安全性。已用于CT分子成像研究的金属有金、银、铂、铋、钽等，由于CT成像需要对比剂的用量大且成本较高，故临床应用的可行性不佳。金具有最易合成和纯化的特性，在过去10年中作为CT对比剂的研究备受关注，其中有直接用聚乙二醇包裹金纳米粒子进行被动靶向成像，也有金纳米粒子通过连接转运载体 （如单克隆抗体）进行主动靶向的。目前以EGFR作为靶分子的CT分子成像研究较少，Reuveni等[28]将EGFR抗体缀合在金纳米颗粒上，静脉注射至人HNSCC荷瘤鼠中，结果显示肿瘤CT值较注射前高5倍[（190±12）HU和（34±5） HU]，而且小肿瘤（直径 4～5 mm）更易显示。胸部CT检查对肺部小结节的检出效果较好，但对其良恶性的鉴别仍有难度。Ashton等[29]将西妥昔单抗结合的金纳米粒子，即C225-金纳米颗粒（C225-AuNPs）注射到荷肺癌A431肿瘤的裸鼠中，肿瘤区的金纳米粒子沉积明显高于对照组，表明C225-AuNPs能够通过靶向EGFR使肺癌特异性成像，具有一定的临床应用价值。

3 小结

肿瘤的靶分子成像是目前的研究热点，EGFR在大多数肿瘤中广泛表达，可以作为肿瘤细胞标志物，临床上已逐渐将其作为靶分子进行成像与治疗，可以提高临床靶向诊断和治疗水平。不同成像方法各有其优势与不足，PET和SPECT是最早用于分子靶向成像研究的成像方法，但其空间和时间分辨力低且有一定的辐射；MRI影像分辨力最高，但扫描时间较长，在HNSCC的EGFR肿瘤分子靶向诊断中较其他成像方法具有独特的优势，并且在胰腺癌的分子诊断方面有一定的潜力[30]。荧光分子成像价格经济，对比剂合成简单，虽然成像质量受组织深度影响，但在内镜检查和手术视野中识别肿瘤有一定优势。PAI成像质量同样易受组织深度影响，但其结合了超声成像和光学成像的优势，具有高空间分辨力和高对比度，并且在进行解剖学成像的同时，还可提供肿瘤血管系统等相关功能信息。CT检查软组织分辨力虽不及MRI且有辐射，但以金纳米粒子合成的EGFR靶向对比剂对鉴别早期肺结节的良恶性有一定价值。总之，以EGFR为靶分子进行成像的不同成像方法具有不同的优势和不足，在肿瘤诊断中可互为补充，对肿瘤的靶向诊断和治疗具有积极的临床意义，但真正应用于临床还需要进行大量的实验研究。在肿瘤的治疗疗效和预后评估方面也有待进一步深入研究。