miRNA检测在结直肠癌诊断及中医药研究中的应用

朱丽， 严晶， 聂炜珏， 孙志广

（1.南京中医药大学第二附属医院，江苏南京 222100；2.南京中医药大学，江苏南京 222100）

结直肠癌（colorectal cancer）是消化系统常见恶性肿瘤之一，发病率在欧美国家居首位，且呈逐年增长趋势。近年来，我国结直肠癌特别是直肠癌的发病率和病死率也呈不断上升趋势，结直肠癌的发病率在我国城市和农村分别占恶性肿瘤发病率的第4位和第6位，严重威胁国民的身心健康[1]。为了降低结直肠癌的死亡率，寻求早期诊断结直肠癌的普查手段是十分必要的。

1 结直肠癌筛查方式概况

结直肠腺瘤是结直肠癌的主要癌前病变，尤其是进展期腺瘤。大约60%以上的结直肠癌都是由结直肠腺瘤演变而来，而由腺瘤发展至癌需要约6～8年的时间[2]。

目前结肠腺瘤及结直肠癌的筛查方法[1]有：（1）大便潜血试验（fecal occult blood test，FOBT）。FOBT是目前应用最为广泛的结直肠癌筛查方法，尽管FOBT简便、安全、经济，并且在结直肠癌普查中取得了明显的成功，但与病理检测相比，FOBT易出现假阳性。（2）肠镜、乙状结肠镜检查。肠镜、乙状结肠镜检查是目前诊断结直肠癌的金标准，诊断结果最为可靠，但存在侵入性、费用高、检测有痛苦、检测操作要求高（除需相应设备场所外，检查医生尚需相应技术资质要求）、且有可能并发肠穿孔等不足。这些因素导致患者的依从性低且难以广泛普及开展。（3）癌胚抗原（CEA、CA-199、CA-724）检测。癌胚抗原如CEA、CA-199、CA-724等虽然可用于筛查肿瘤，但是对结肠癌没有特异性，且经此检出的结直肠癌多属中晚期，故仅作为诊断的辅助手段。（4）粪便DNA检测。DNA检测包括DNA突变、DNA完整性、癌症相关甲基化分析等。粪便DNA检测虽然无创，敏感性和特异度也较理想，但因操作复杂、费时、检测成本太高而限制了推广。（5）粪便免疫化学法检测（fecal immunochemical test FIT）。FIT和FOBT类似，但FIT依赖于抗体检测发现下消化道的肿瘤出血，比FOBT敏感性和特异性高。不足的是，FIT中使用的抗体的不稳定性使它在转运和储存中容易分解并影响效果[3]。

随着对结直肠癌的分子发生机制的深入理解，在腺瘤发展为腺癌的过程中，许多微小RNA（microRNA或miRNA）表达出现异常，且miRNA在粪便/血液中有极强的稳定性和特异性，因此，miRNAs可作为结直肠腺瘤—腺癌临床早期检测及诊断结直肠癌的特异性新型生物标志物。目前已有大量研究表明多个miRNA在诊断结直肠癌中具有特异性及敏感性[4]，故考虑联合多个miRNA基因检测，以提高诊断结直肠癌的精准度。寻找结直肠腺瘤癌变发展序列过程中特异表达的非侵入性分子标记物miRNA，以及筛查出与结直肠腺瘤形成及癌变进展相关的miRNA，将对防治结直肠癌具有重要的理论意义和实践价值。

2 miRNA标志物在结直肠癌诊断的应用

miRNA是一种含有21～23个碱基的内源性单链小分子RNA。目前已经证实miRNA广泛存在于各种真核生物细胞内，能完全或部分与其靶基因的mRNA分子的3'端非编码区域发生碱基的配对，完全匹配的结合可使靶基因mRNA降解，而不完全匹配的结合则使靶基因mRNA的翻译受到抑制，从而诱导靶基因mRNA发生降解，最终抑制靶基因转录为蛋白质的进程。这些非编码小分子RNA参与调控了大约人类基因组中30%的基因表达，可影响细胞增殖、分化、凋亡等过程。miRNA作为一类高度保守的小分子非编码RNA参与了结直肠癌的发生、发展、淋巴结转移、远处转移及复发等多个过程，根据其调控的基因不同而发挥致癌因子作用或抑癌因子作用，其表达量的变化可作为疾病诊断或预后的标记物。

miRNA的异常表达对癌细胞的增殖分化具有促进作用，可表现为原癌miRNA的表达上调和抑癌miRNA的表达下调。原癌miRNA主要包括let-7b/g、miR-9、miR-17、miR-20、miR-21、miR-31、 miR-92a、 miR-96、 miR-135、 miR-141、miR-155、miR-205、miR-214、miR-224、miR-372、miR-708等。其中被研究最多的是miR-21，在许多癌病中miR-21都被认为是原癌miRNA。在结直肠癌中miR-21能通过靶向抑癌基因（如PDCD4、 TIAM1、 SPRTY、 PTEN、 TGFBR2、CDC25A等）促进肿瘤细胞的增殖和转移[4]。而miR-92a则是通过抑制E-cadherin促进上皮间质转化（EMT）[5]。抑癌miRNA主要包括let-7a、miR-7、miR-18a、miR-26b、miR-27b、miR-34a、miR-101、miR-125、 miR-138、miR-143、miR-144、miR-145、miR-194、miR-195、miR-320a、miR-365、miR-491等。研究较多的miR-143和miR-145通过下调胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）起到抑癌作用[6]。

2.1 血清miRNA与腺瘤及其癌变的相关性 通过检测正常结直肠组织、结直肠管状腺瘤、管状绒毛状腺瘤及结直肠腺癌这一序贯发生的组织变化系列中miRNA的表达水平，可用于临床分析正常结直肠组织、癌前病变、结直肠癌中的miRNA表达差异。

刘揆亮等[7]的研究表明，血清miR-204与miR-193b能成为诊断结直肠癌的生物标志物，miR-193b可能在腺瘤—腺癌序列中发挥抑癌作用。张婷[8]报道，结直肠腺瘤患者的miRNA-101在腺瘤组织中的表达高于腺瘤旁组织，在癌组织中的表达低于癌旁组织（P＜0.05）。朱林林等[9]证实在管状腺瘤中miR-1、miR-9、miR-137、miR-145的表达均低于瘤旁正常组织，miR-31、miR-135a的表达均高于瘤旁正常组织，在管状绒毛状腺瘤中miR-1、miR-137、miR-145的表达均低于瘤旁正常组织，miR-9、miR-135a、miR-31的表达均高于瘤旁正常组织；在结直肠腺癌组织中miR-1、miR-9、miR-137、miR-145的表达均低于癌旁正常组织，而miR-31、miR-135a的表达高于癌旁正常组织。由此认为正常结直肠组织、结直肠腺瘤、结直肠癌中miRNA存在差异表达，提示上述miRNA在从正常结直肠组织到结直肠腺瘤、结直肠腺瘤到结直肠癌的发生发展过程中可能发挥作用[9]。

范慧娟[10]的研究发现，miR-661、miR-591可能成为结直肠腺瘤和结直肠早期癌的非侵入性候选分子标志物，miR-215、miR-193b-3p、miR-302b-3p可能在结直肠腺瘤癌变中发挥作用。杨燕楠等[11]的研究发现，miR-499-5p的表达水平在正常结肠、结肠腺瘤、结肠癌姐织中呈逐渐増高的趋势，说明其在结肠癌的癌变过程中呈动态变化。有研究者报道miR-15a-3p能促进腺瘤发展至结肠癌[12]。刘华[13]的研究发现，miR-21在结直肠癌和结直肠腺瘤病变组织及患者血清中表达显著升高（P＜0.001），且miR-21在结直肠癌组中的表达明显高于结直肠腺瘤组（P＜0.05）。

刘华等[14]对受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线）的分析结果显示：对于鉴别结直肠癌与健康者，血清miR-21、miR-146a及二者联合检测的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.889、0.791和0.863；鉴别结直肠腺瘤与健康者，其AUC分别为0.784、0.692和0.761；鉴别结直肠癌与结直肠腺瘤者，其AUC分别为0.705、0.820和0.713；结果提示血清miR-21和miR-146a的差异表达在结直肠癌的早期诊断中具有潜在的价值。 Nuñez-Sánchez M A 等[15]报道，结直肠小管腺瘤组织中的miR-1、miR-9、miR-137和miR-145表达减少，miR-31和miR-135a表达增加；结直肠小管绒毛腺瘤组织中的miR-1、miR-137、miR-145水平下降，miR-9、miR-135a和miR-31水平升高；结直肠癌组织中的miR-1、miR-9、miR-137和miR-145表达减少，miR-135a和miR-31表达增加。结果提示血清miR-20a和miR-486可作为结直肠腺瘤患者潜在的无创生物标志物。

2.2 粪便miRNA与结直肠腺瘤及其癌变的相关性 胡晶晶等[16]报道，早期的结直肠癌患者粪便中的miRNA-221表达上调，可能参与疾病的发生，提示粪便miRNA-221有可能成为诊断早期结直肠癌的无创标志物。钟武等[17]的研究表明，Ⅲ＋Ⅳ期结直肠癌患者粪便中miRNA-21的表达水平要高于Ⅰ＋Ⅱ期结直肠癌患者（P＜0.05），低分化患者高于中高分化者（P＜0.05），有淋巴结转移患者明显高于无淋巴结转移者（P＜0.05）；结果提示结直肠癌患者粪便miRNA-21表达的升高可能与肿瘤的发生、发展有关，粪便miRNA-21可能成为结直肠癌潜在的肿瘤标记物，为结直肠癌的早期筛查及诊断提供了新的思路。储怀祝等[18]对粪便中miRNA-21表达用于结直肠癌诊断的文献进行荟萃分析，发现灵敏度欠佳，但特异性较好，而多个miRNA联合诊断结直肠癌能够降低误诊率。王静[19]的研究表明，联合检测人血浆及粪便中miR-92a-1表达水平在结直肠癌诊断及筛查中具有潜在的应用价值。韦皓棠[20]的研究表明，结直肠癌患者粪便中miRNA-21、miRNA-31、miRNA-92a、miRNA-143的表达与健康志愿者粪便中的表达具有明显差异，可作为结直肠癌诊断的潜在肿瘤标志物，miRNA-21与miRNA-143的联合检测有望为结直肠癌筛查提供一种无创且敏感性与特异性较高的诊断方法。miRNA在粪便中的检测效果较少受到粪便性质的影响，与粪便中是否有隐血，是否使用抗生素，饮食的种类等均无关，故粪便中的miRNA联合检测在结直肠癌的筛查中是有一定的前景的。

3 miRNA检测结直肠癌对中医药研究的意义

《医宗金鉴》描述结直肠癌的病因病机及病症表现如下：“此证有内外、阴阳之别。发于外者，由醇酒厚味，勤劳辛苦，蕴注于肛门，两旁肿突，形如桃李，大便秘结，小水短赤，甚者肛门重坠紧闭，下气不通，刺痛如锥，脉数有力，多实多热，属阳易治，宜服一煎散，通利二便，菩提露搽之；肿痛仍前，不全退者，脓将成也，宜服托里透脓汤；脓胀痛针之；脓出之后，治同溃疡门。发于内者，兼阴阳湿热，下注肛门，内结臃肿，刺痛如锥，大便虚闭，小水淋漓，寒热往来，遇夜尤甚，脉数微细，为虚为湿，属阴难治，宜服五灰散，脓毒自然溃出；脓生迟者，服十全大补汤托之，溃后按溃疡门”。可见，结直肠癌的中医病机邪实与正虚同时存在的，邪实以痰湿、火热、癖毒多见，正虚以正气亏虚为主。

中医的痰湿、火热、癖毒与现代医学中的炎症介质类似。肠癌细胞会释放大量炎症介质，诱导肿瘤生长、转移，而miRNA会随着炎症介质含量的变化而发生相应变化[21]。越来越多的证据表明，miRNA在不同组织、器官、细胞的生长发育过程中，其表达谱存在很大差异，即miRNA的表达具有时序特异性与组织特异性，而中医的“证”也有即时性与差异性的特点，在这方面二者有相似的特性[22]。不同中医证型患者血清miRNA的表达不同，若能建立血清miRNA的表达水平与证型的对应关系，则可弥补宏观辨证的不足，将有助于辨证的客观性和准确性，从而指导临床处方用药[23]。因此，通过检测结直肠癌患者血清中miRNA表达数值的变化，从而得出结直肠癌不同证型患者血清miRNA表达谱，将为临床上应用中药治疗不同证型结直肠癌患者疗效的评估提供可靠的依据。

综合以上分析可知，结直肠腺瘤或结直肠癌患者的血清及粪便中均可检测出相关miRNA，以患者血清或粪便miRNA表达水平并结合其他实验室指标的变化数值作为结直肠癌疗效预测的生物标记物，在临床过程中将患者分层，实施个体化治疗，做到科学、合理、安全的用药，可提高临床疗效。明确中医不同证型患者血清miRNA表达谱的不同，并将miRNA表达水平作为中医微观辨证的生物标志物，可为实现中医药个体化治疗奠定基础。