免疫检查点PD-1/PD-L1抑制剂与CAR-T治疗在肝癌中的研究进展

周疆帆，单云峰

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325035，1.介入科，2.肝胆外科）

免疫治疗作为一种新的癌症治疗策略，在基础理论与临床上已经研究了多年。与传统的癌症疗法不同，免疫治疗并不直接作用于靶向肿瘤细胞，而是针对患者的免疫系统或肿瘤微环境，使患者无效或受抑制的免疫系统复活，使其能够再次对肿瘤细胞发起持续的溶细胞攻击，理想情况下可彻底根除癌症[1]。现阶段主要是通过以下几种途径来实现这一目标：免疫检查点抑制剂、淋巴细胞促进细胞因子、工程化T细胞[例如嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和T细胞抗原受体细胞（TCR-T）]、共刺激受体的激动性抗体和癌症疫苗[2]。肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌最常见的类型，目前已在HCC中评估了多种免疫治疗策略的疗效，尤其是在免疫检查点抑制剂方面。免疫检查点抑制剂靶向主要为T细胞或肿瘤细胞表达的多个检查点分子，从而激活免疫系统的抗肿瘤效应。其中，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）抑制剂（tremelimumab和ipilimumab）和程序性死亡蛋白1（PD-1）抑制剂（nivolumab和pembrolizumab）及其配体PD-L1抑制剂（atezolizumab和durvalumab）已显示出对晚期HCC的潜在治疗作用[3]。另外，随着基因编辑技术的发展，工程化免疫细胞输注也成为抗HCC治疗的重要方向。CAR-T疗法提取患者自身循环中的免疫T细胞，在体外利用基因工程技术制备CAR-T细胞，扩增后回输入患者体内，达到识别、杀伤肿瘤细胞的目的[4]。本文主要讨论免疫检查点PD-1/PD-L1抑制剂和CAR-T疗法在当前肝癌治疗领域发展的概况。

1 PD-1/PD-L1

PD-1基因最初由Tasuku Honjo领导的小组于1992年发现并分离[5]。PD-1属免疫球蛋白基因超家族，Honjo在研究中描述了小鼠受刺激后T、B淋巴细胞表面表达PD-1抗原，并表明PD-1在免疫反应的晚期被激活，参与免疫效应、记忆反应和周围组织的慢性感染[6]。PD-L1在2000年被Honjo研究团队鉴定为PD-1配体，它是一种由抗原呈递细胞表达的受体，主要分布在心脏、肺、肾脏和胎盘中[7]。随后2001年，研究鉴定了PD-1的第二种配体，即PD-L2，并证明了PD-1配体在肿瘤细胞系中的异常表达[8]。该报告提示PD-1与其配体在微调T细胞功能和维持免疫系统稳态中表现出重要的生理学作用，并首次建议阻断PD-1途径可能增强抗肿瘤免疫力。

目前，已知PD-L1在非淋巴和淋巴组织中表达，而PD-L2的表达更受限制。在造血细胞，特别是抗原呈递细胞（例如树突状细胞和巨噬细胞）被外源肽激活后，PD-L1的表达上调。PD-L1也在不同的肿瘤细胞和感染病毒的细胞中表达，与PD-1结合后，它直接抑制T细胞的增殖和功能，例如干扰素IFN-γ的产生[9]。在介导这类抑制性反馈的免疫检查点受体中，PD-1/PD-L1已成为研究最深入的受体之一。多数肿瘤细胞正是利用这一检查点的负调控来抑制机体免疫并逃避免疫监视[10-11]。因此，现阶段已经提出了“免疫检查点封锁”的概念，并着手测试免疫检查点抑制剂在癌症管理中的抗肿瘤效应[12]。

临床上大多数晚期肿瘤的免疫原性很弱，包括HCC[13]。在肿瘤的生长和发展过程中，肝微环境中有效的免疫监视功能受到损害，免疫检查点，特别是PD-1/PD-L1信号通路参与了上述过程[14]。在HCC患者中，PD-1在CD8+T细胞中的表达增加[15]，并且在未曾接受免疫疗法的肝部分切除患者中，循环性和肿瘤浸润性PD-1+CD8+T细胞的高丰度与疾病进展正相关[16]。在HCC患者中也观察到PD-1在肿瘤浸润淋巴细胞上的高表达可导致淋巴细胞衰竭表型和效应功能受损[16-17]。另外，HCC细胞中PD-L1的表达也抑制了肿瘤微环境中T细胞的功能。有研究报道肿瘤细胞上高PD-L1表达为HCC患者复发的独立预后因子[18]。肝癌切除样本分析结果显示，未接受过免疫疗法的患者中PD-L1的表达水平较高，而且与肿瘤侵袭性[19]和预后不良[20]相关。然而，在晚期肝癌患者中，PD-L1在肿瘤细胞上的基线表达对PD-1阻滞疗法的客观反应率没有影响。CheckMate-040临床试验对基线收集的肝肿瘤进行了回顾性评估，其中20%的患者PD-L1在≥1%的肿瘤细胞上表达，大多数患者PD-L1在＜1%的肿瘤细胞上表达，大多数HCC患者对PD-1阻滞剂表现出客观的临床反应，与另一小部分患者相比无明显差异[21]。最近的一项研究证实了这一点，其中PD-1阻滞治疗的临床反应与晚期HCC中的PD-L1染色水平无关[22]，但不足的是，该研究中纳入的患者数量非常有限（n=10），结论有待扩大样本验证。

阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用在不同肿瘤类型的患者中产生深刻且持久的抗肿瘤效应。尽管在非小细胞肺癌中，PD-1阻滞的客观反应率比PD-L1阻滞高5%，PD-1和PD-L1阻滞在很大程度上显示出相似的疗效[23]。靶向PD-1/PD-L1的药物在肝癌治疗领域也掀起了一场革命[24-25]。

2 PD-1/PD-L1免疫抑制剂

2.1 Nivolumab

Nivolumab是一种PD-1抑制剂，于2017年被FDA批准为存在索拉非尼耐药的晚期HCC的二线治疗药物。由El-Khoueiry AB领导的一项多中心I/II期试验（CheckMate-040）对Nivolumab单药作为进展期肝癌患者一线治疗药物的安全性和有效性进行了评估[21]。该研究纳入了来自不同国家和地区的患有或不患有慢性病毒性肝炎（HBV或HCV）的晚期HCC患者，HBV感染患者需要接受有效的抗病毒治疗，病毒载量小于100 IU/mL，HCV感染患者不需要抗病毒治疗。不排除接受过索拉非尼治疗的患者，但排除先前接受过靶向T细胞共刺激或检查点途径的药物。研究分为两个阶段：剂量递增阶段（每2周给予一次0.1～10 mg/kg Nvolumab静脉注射）与剂量扩大阶段（每2周给予一次3 mg/kg Nivolumab静脉注射）。剂量递增阶段要求患者的Child-Pugh评分为7或更低（Child-Pugh A或B7），剂量扩大阶段要求评分为6或更低。结果表明，在剂量递增阶段，患者总体客观缓解率为15%，疾病控制率为58%，总体生存期为15个月。在剂量扩大阶段，超过200例接受Nivolumab治疗的患者6个月生存率达83%，9个月生存率达74%。研究还表明，Nivolumb具有可控的安全性。另外，CheckMate-040研究的一个亚组正在评估Nivolumab联合Ipilimumab（CTLA-4抑制剂）对索拉非尼耐药的患者的临床疗效（NCT01658878）。初步结果显示患者客观缓解率为31%，中位持续反应时间为17个月，不同治疗方案的总体生存期在12～23个月之间[26]。还有另外两项II期临床研究评估了该联合治疗方案：其中一项研究是在美国比较Nivolumab单药与Nivolumab联合Ipilimumab（NCT03222076），另一项研究则是在中国台湾地区评估Nivolumab联合Ipilimumab的临床疗效（NCT03510871）。2019年6月24日，Bristol-Myers Squibb公司发布了一项随机、多中心的III期试验（CheckMate-459），评估比较了Opdivo（Nivolumab）与索拉非尼作为不可切除的HCC患者的一线治疗的疗效。但是按照预先设定的统计标准，目前其生存期随访尚未达到主要终点，具体数据也未发布。无论如何，该试验揭示了与索拉非尼相比，接受Opdivo治疗的患者总体生存期有明显改善的趋势，这一现象将鼓励我们继续在肝癌中探索Opdivo的临床价值[27]。

2.2 Pembrolizumab

Pembrolizumab是一种重组单克隆人免疫球蛋白IgG4抗体，对人PD-1检查点具有特异性，FDA于2019年批准Pembrolizumab用于治疗无法切除或转移性黑色素瘤的患者。由Zhu AX领导的一项多中心的II期临床研究（KEYNOTE 224）评估了Pembrolizumab在晚期肝癌患者中的安全性与有效性[28]。研究纳入经索拉非尼治疗不耐受或者进展的HCC患者，Child-Pugh A级。受试者每3周接受一次静脉注射200 μmg Pembrolizumab，持续约2年，直到疾病进展或出现不可接受的药物毒性。结果表明，受试患者完全缓解率为1%，部分缓解率为16%，稳定率为44%。Pembrolizumab在晚期HCC患者中实现了17%的肿瘤缓解率和60%以上的疾病控制率，并且可以长期维持，总体生存期达到12.9个月。另外，这些受试者中有76例（73%）出现了与治疗相关的不良反应，其中严重的有16例（15%）。3例（3%）患者出现了免疫相关性肝炎，但是没有病毒爆发的报道。根据该试验，Pembrolizumab对于先前接受过索拉非尼治疗的晚期HCC患者有效且可耐受，该药物今后可能是这些患者的治疗选择[28]。2019年美国FDA已经批准了Pembrolizumab用于肝癌二线治疗的优先审查申请，并开展了KEYNOTE-240试验（Pembrolizumab的III期临床研究）[29]。不幸的是，3个月后KEYNOTE-240试验宣布失败。尽管该试验的意义未达到预先设定的统计标准，但是与安慰剂组相比，Pembrolizumab降低了22%的死亡风险并延长了无进展生存期。此外，Pembrolizumab治疗组的客观缓解率和安全性都与KEYNOTE-224试验结果一致，这些结果进一步支持了Pembrolizumab作为HCC患者的二线治疗的可能性。目前还有Pembrolizumab联合多激酶抑制剂Lenvatinib的研究在HCC患者中进行I期试验，初步结果显示，根据mRECIST标准有46%的受试患者疾病可达部分缓解或稳定[30]。

2.3 Atezolizumab

Atezolizumab是一种人源单克隆IgG1抗体，已被批准用于转移性非小细胞肺癌、不可切除或转移性尿路上皮癌的一线和二线治疗。目前，Atezolizumab联合抗-VEGF单克隆抗体Bevacizumab与索拉非尼作为晚期肝癌一线治疗方案的比较性III期随机对照试验已开始（NCT03434379）。最近发布了该III期研究的初步结果，与索拉非尼相比（400 mg每天两次，周期21天），Atezolizumab（1天内静脉注射1 200 mg，周期21天）联合Bevacizumab（1天内静脉注射15 mg/kg，周期21天）患者总体生存期和无进展生存期均有改善，但研究尚未达到主要终点[31]。

2.4 Durvalumab

Durvalumab也是一种人源单克隆IgG1抗体，能够阻断PD-L1与PD-1、CD80的相互作用，已被批准用于治疗局部进展期小细胞肺癌和尿路上皮癌。目前已完成Durvalumab单药治疗实体癌的I/II期试验（纳入30例HCC患者） （NCT01693562），研究显示受试者客观缓解率为10%，中位生存时间为13.2个月[32]。另外，在一项包含40例HCC患者的I/II期试验中，研究者联合使用Durvalumab和Tremelimumab（CTLA-4抑制剂），患者总体客观缓解率为15%，表明这种联合疗法比Durvalamab单药治疗更有效，联合用药安全性也易于管理[33]。目前，正在进行III期临床试验以比较不同方案作为一线治疗手段的价值，包括Durvalumab单药疗法，Durvalumab+Tremelimumab联合疗法（方案1和2）以及索拉非尼单药疗法（NCT03298451）。

3 CAR-T治疗

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法是一种新兴的精准医学治疗手段，近年来得到了快速发展，被普遍认为是人类最有希望攻克癌症的创新疗法之一。嵌合抗原受体CAR是CAR-T的核心部件，其典型结构包括细胞外抗原识别结构域、铰链/间隔结构域、跨膜结构域和T细胞激活结构域[4]。相较于天然T细胞表面受体，CAR赋予T细胞HLA非依赖性方式识别肿瘤抗原的能力，精确介导不受MHC限制的肿瘤细胞杀伤效应，具有传统过继免疫疗法无法比拟的优势[34-35]。现有的研究表明CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤的治疗中发挥了出色的作用，2017年来两种CAR-T细胞治疗产品：Kymriah和Yescarta经FDA批准用于急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤的一线治疗[36-37]。

为了发展对实体癌的CAR-T疗法，需要探索在癌细胞表面大量表达的特异性抗原分子。Glypican-3（GPC3）是HCC CAR-T细胞治疗引人注目的靶标，因为它在大多数HCC组织中过表达，但在健康的成人组织中表达受限，并且与HCC患者的不良预后相关[38-39]。

2014年，研究首次报道了靶向GPC3的CAR-T细胞在体外特异性杀伤GPC3阳性HCC细胞，并可以显著延长HCC异种移植模型的存活期[40]。根据临床试验统计结果（https://clinicaltrials.gov/，截至2019年6月27日），现已注册11种GPC3-CAR-T疗法的相关研究。其中，有9项分享了当前的进展状况，包括2项试验已经完成，3项正在进行中，4项正在准备中[41]。研究还评估了不同的应用途径，包括CAR-T细胞经肝动脉输注、全身输注、结合经动脉化学栓塞或者淋巴结清扫。I期研究（NCT02395250）初步分析结果显示，受试者中有1例局部缓解和2例基本稳定（来自6例可评估患者），所有患者耐受期均超过一年，并且与GPC3-CAR-T一起应用淋巴结清扫术可以起到一定的疗效。该结果提示GPC3-CAR-T疗法在中国难治性或复发性GPC3阳性HCC患者中是安全的[42]。另外，共表达GPC3和去唾液酸糖蛋白受体1（ASGR1）的双重靶向CAR-T细胞在HCC中可以发挥卓越的抗癌活性[43]。在小鼠模型中还进行了联合使用GPC3-CAR-T治疗与索拉非尼或PD-1抑制剂的验证研究[44-45]，结果显示应用亚药理剂量的索拉非尼或构建PD-1缺陷型小鼠，能够增强CAR-T细胞的抗HCC作用，证明了索拉非尼与GPC3-CAR-T疗法联合使用的临床潜力，也暗示在免疫检查点上进行精确基因编辑可以增强CAR-T疗法的抗肿瘤能力。

除了GPC3，研究在列的肿瘤特异性表面受体还有CD133、CD147等。CD133-CAR-T疗法的I期临床试验（NCT02541370）表明，CAR-T细胞治疗CD133阳性HCC晚期患者有一定的可行性[46]。与CD133相似，CD147在肝癌组织中高表达，阳性率为75%～80%，CD147-CAR-T细胞在肝癌中也发挥抗肿瘤作用[47]。另外，在一些实体瘤中，表皮生长因子受体（EGFR）、人表皮生长因子受体2、双唾液酸神经节苷脂2、间皮素和白细胞介素13 α2也是CAR-T技术目前的靶标，但它们能否在HCC的治疗中起到有效作用还有待进一步验证[35，48]。

血液系统恶性肿瘤以及实体瘤患者临床持续缓解的关键因素在于CAR-T细胞在体内的稳定增殖和持久效应。最初设计的CAR-T细胞的抗肿瘤活性在体内会受到限制，应用过程中会发生T细胞增殖减少最终导致T细胞的凋亡。因此为了改进CAR，许多研究者在CAR的序列中增加一个或多个新的共刺激信号，比如CD28，OX40，41BB等，采用不同共刺激信号的CAR-T细胞显示出不同的抗肿瘤活性。与41BB相比，共刺激CD28优先产生Th2细胞因子（白介素4/白介素10），在体外表现出更强的细胞毒性，而共刺激41BB CAR-T细胞增殖能力明显增强，并优先产生Th1细胞因子（干扰素IFN-γ，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）[49]。不同的研究者在体内外研究中得到的结果不尽相同，但与初代CAR相比，这种设计能够增加对肿瘤细胞裂解的记忆效应以及CAR介导的杀伤效应。另外，有研究在小鼠模型中构建了一种表达白介素7（IL-7）和趋化因子（C-C基序）配体19（CCL19）的CAR-T细胞，并提出诱导CAR-T细胞增殖以及促进其迁移（prime CAR-T）可以有效增强CAR-T疗法的功效[50]。IL-7刺激T细胞的存活和增殖，而CCL19促进T细胞和树突状细胞的迁移，在淋巴器官中，T区网状成纤维细胞产生的IL-7和CCL19对于T区的形成和维持至关重要。Prime CAR-T技术模拟了T区网状成纤维细胞的功能，将T细胞动员到肿瘤组织中，能够显著改善抗肿瘤效应。因此，开展临床试验与积累针对实体瘤的Prime CAR-T治疗的经验，可能会为优化CAR-T疗法提供新的思路。

与血液系统恶性肿瘤相比，实体瘤内普遍负荷广泛的基因突变，因此CAR-T技术难于确认合适的肿瘤抗原。另一方面，工程CAR-T细胞在肿瘤中的定位也受肿瘤血管生成、趋化因子水平高低影响。肝癌组织也常常合并纤维化，不允许大分子充分渗透组织[51]，不过这可能可以通过局部给药如选择性肝动脉灌注来克服。

4 免疫治疗与未来展望

尽管许多研究证明免疫疗法可以改善HCC的临床预后，但事实上此类治疗目前仅使少数患者获益。临床实践中，免疫检查点抑制剂的有效率大约在10%～20%之间，而在二线治疗中更是少于10%，其中多达30%～40%的患者对这些药物没有反应。究其原因，除了肝脏特有的免疫细胞外，与慢性肝病相关的其他因素也可能影响患者对该免疫治疗的反应。一些实体瘤中，肠道菌群的组分已成为影响个体对免疫检查点抑制剂的反应能力的主要因素之一，并且这个现象与HCC特别相关，因为慢性肝病患者易于发生肠道菌群改变[52-53]。研究表明，在接受免疫检查点抑制剂之前，施用抗生素会降低癌症免疫疗法的功效，而在特定的肠道微生物的存在下（例如双歧杆菌属、阿克曼菌、埃希氏大肠杆菌等），观察到了更好的疗效[54-57]。研究也分析PD-1阻滞疗法的反应者和无反应者之间肠道菌群的组成区别。对于转移性黑色素瘤，反应者中多富集梭状芽胞杆菌属，而无反应者中多富集拟杆菌属[58]。基于这个现象，目前甚至已经提出使用噬菌体特异性清除不利细菌作为增强免疫疗法功效的潜在干预工具。

另外，PD-1/PD-L1阻滞可能与CAR-T疗法之间存在潜在的联系。CAR-T细胞的强劲扩增和功能持久对于体内抗肿瘤功效至关重要。Cherkassky L等[59]证明了抑制PD-1受体能够减弱PD-1途径对CAR-T细胞的抑制，增强CAR-T细胞的增殖能力。同时，Guo X等[44]的研究表明，暴露于GPC3-CAR-T细胞的HCC细胞PD-L1表达上调，经CRISPR技术敲除PD-1基因可以增强CAR-T细胞抗肿瘤活性。这些现象一定程度上说明在免疫抑制性HCC微环境中，PD-1/PD-L1途径有可能影响CAR-T细胞疗法的功效。另外，重复的抗原刺激可以诱导T细胞衰竭和缺失。Guo X等[44]在研究中发现输注PD-1缺陷型CAR-T细胞治疗13 d后，肿瘤停止消退并重新生长。不过这一现象不能排除由PD-1缺失引起的替代检查点分子的代偿性上调对CAR-T细胞功能的抑制。Huang RY等[60]发现在转移性卵巢癌细胞中分别单独阻滞PD-1，LAG-3或CTLA-4时，其他的免疫检查点分子会相应上调。因此，免疫检查点抑制剂的代偿效应在如今研究肝癌免疫微环境与CAR-T治疗方面也起着重要作用，其中机制有待进一步阐明。