细菌素疗法在抗感染领域的研究进展

胡杏，张红霞，张波，王睿，王瑾，蔡芸,*

(1 解放军医学院，北京 100853；2 重庆医科大学药学院，重庆 400016；3 中国人民解放军空军总医院，北京 100853；4 中国人民解放军总医院药物临床研究中心，北京 100853)

青霉素等传统抗菌药物的应用，一度使由细菌感染所致的疾病得到良好控制。但随着细菌耐药性的产生，使细菌感染性疾病的治疗面临更多困难。临床上合理应用抗菌药物可延缓细菌耐药性的产生，但不能从根本上解决传统抗菌药物耐药问题，故寻找其有效替代品有望从根本上解决问题。

细菌素是具有抗菌活性的多肽类物质，在自然界中广泛存在，作为细菌的先天防御机制之一，大多数细菌[1]能合成至少一种细菌素。乳酸链球菌素(nisin)是研究得最广、最深入的细菌素，可以抑制很多食源性致病菌和腐败菌，已广泛用于食品防腐，并且是唯一进行商业化生产的细菌素[2]。细菌素有独特的抗菌机制，且有低毒或无毒、无抗药性、高效、耐酸、热稳定性等特点，逐渐引起了越来越多的关注和研究。

1 细菌素的定义和特点

细菌素最早被发现于1925年。目前认为，细菌素是指由革兰阳性菌和革兰阴性菌经核糖体途径合成的、具有抗菌活性的多肽或蛋白质[3]。革兰阳性菌是主要的产生菌，目前已知的细菌素主要由乳酸杆菌产生，除此之外，芽孢杆菌也是重要的生产菌。

细菌素的一些特点，决定了其有望在临床抗感染领域发挥一定的作用。首先，在人体安全性方面，细菌素为多肽类或蛋白质，在人体内可被蛋白酶分解，不易对人体产生毒性；细菌素具有低免疫原性，应用于人体，免疫反应发生风险较低[4]。其次，在抗菌活性方面，某些细菌素极低浓度即可发挥抑菌作用，有效浓度可为毫微摩尔级[5]，比如一项研究[6]发现，双歧杆菌细菌素Bifidoicn A对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度MIC(minimum inhibitory concentration)值仅为0.058μg/mL。而且，非常值得关注的一点是，细菌素很少诱发抗细菌素性菌株，这是优于传统抗菌药物的一大优势。此外，某些细菌素还具有耐酸性、热稳定性和广谱抗菌活性，如大部分乳酸菌细菌素带正电荷，在酸性条件下较稳定、可发挥抑菌活性；多项研究表明I、II类细菌素具有热稳定性，例如面包乳杆菌C-M2产生的细菌素在121℃灭菌15min后，抑菌活性仍可保留82.1%，并且该细菌素还具有广谱抗菌活性，对革兰阳性细菌和革兰阴性细菌均有抑制作用[7]。

2 细菌素的分类及作用机制

随着对细菌素研究的深入，其分类在不断进行修改，并且按不同的标准可以进行不同的分类。

较为广泛接受的分类提出于1993年[8]，此次分类是基于分子量大小、结构和热稳定性，将细菌素分为4类。I类：分子量＜5kDa的多肽，含修饰氨基酸(羊毛硫氨酸或β-甲基羊毛硫氨酸)，具有热稳定性，可分为Ia、Ib两个亚类。II类：分子量＜10kDa的多肽，具有热稳定性，可分为IIa、IIb、IIc三个亚类。III类：分子量＞10kDa的蛋白，对热的稳定性较差，通常100℃或更低温度30s即可失活。IV类：是与碳水化合物或脂类结合的复合蛋白。在此基础上，按是否含修饰氨基酸分为两类：羊毛硫细菌素类和非羊毛硫细菌素类。羊毛硫细菌素类的产生需要翻译后修饰，通常对革兰阳性细菌具有广谱抗菌活性；非羊毛硫细菌素类的产生不经过结构修饰，抗菌谱较窄。

此外，还有一些其他的分类方法，如按产生菌革兰染色[10]分类，分为 革兰阳性菌细菌素和革兰阴性菌细菌素。前者主要由乳酸菌分泌，目前已发现≥8个不同种属的乳酸菌能分泌细菌素，按产生菌的不同种属可以更加细化地进行命名和分类：如乳杆菌属细菌素、乳球菌属细菌素、明串珠菌属细菌素、肠球菌属细菌素、链球菌属细菌素、片球菌属细菌素、肉食杆菌属细菌素、双歧杆菌等细菌素；后者主要由大肠埃希菌产生。

目前，对于I类、II类细菌素的作用机制研究得相对清楚，III类、IV类细菌素的作用机制研究还不深入。关于细菌素的作用机制，主要有三种观点：在靶细胞膜形成孔道、干扰靶细菌细胞壁的合成以及抑制ATP、蛋白质、DNA、RNA等靶细菌胞内物质的合成。

通常认为细胞膜形成孔道、胞内物质外泄是主要抗菌机制。I类细菌素通过静电作用吸附至靶细胞膜，与靶细胞细胞壁上lipid II(类脂II)结合形成复合物插入靶细胞膜，形成亲水孔道，胞内K+外泄，细胞膜去极化，导致ATP、蛋白质、DNA、RNA等合成障碍，胞外液体进入胞内，最终使靶细胞 裂解死亡。II类细菌素形成亲水孔道由靶细胞膜上的受体蛋白介导，其N端β折叠区域通过识别靶细胞膜上甘露糖磷酸转移酶系统(MPTs)N端的胞外环，片段PA-1与靶细胞相互作用，通过静电吸引，N-末端保守结构域与MPTs相结合，疏水性C-末端结构域插入靶细胞膜形成亲水孔道[11]。

但目前 随着对细菌素研究的深入，发现细菌素的抑菌作用，可能是多种机制共同作用的结果[12]。比如，Nisin是典型的羊毛硫细菌素，研究发现其通过双重机制发挥作用：在靶细胞膜表面形成孔道，并通过结合细胞壁合成的前体物质lipid II抑制细胞壁的合成导致靶细胞分裂，这使得Nisin在纳摩尔浓度即可发挥良好的抗菌活性。对于细菌素的作用机制，目前多是假说，详细机制还有待于进一步的研究。

3 细菌素在抗感染领域的应用

3.1 细菌素在口腔疾病中的应用

口腔细菌常以生物膜方式存在而致病，牙菌斑是牙周病和龋病的始动因素，具有典型的生物被膜结构。研究发现[14]植物乳杆菌NC8产生的细菌素PLNC8αβ，能使牙龈卟啉单胞菌菌膜裂解、内容物外泄，抑制牙龈卟啉单胞菌的定植和致病性。多项研究[15-16]表明Nisin与传统抗菌药物有协同作用，具有抑制生物被膜的特性[17]：Nisin联合氯霉素对假中间型葡萄球菌DSM21284生物被膜有协同作用，而Nisin14V联合青霉素主要对DSM21284浮游菌有效；1/4MICNisin+1/2 MIC多黏菌素或1/5MIC黏菌素均能抑制铜绿假单胞菌PA-01生物被膜的形成。

血链球菌是口腔中的益生菌，研究[18]发现血链球菌细菌素对浮游状态下和生物膜中的牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌生长均有显著的抑制作用。进一步的研究[19]表明血链球菌细菌素作用于牙龈卟单胞菌后，可引起牙龈卟啉单胞菌形貌学性质改变(菌体直径减小、平均粗糙度增加、平均峰高度增加)和力学性质改变(黏附力下降、杨氏模量降低)。

细菌素对于牙周病、龋病等的防治作用目前虽处于探索阶段，但多方面的研究已提示细菌素在未来口腔疾病的治疗方面有一定的应用前景。

3.2 细菌素 在胃肠道疾病中的应用

胃肠道微生物群落在机体药物代谢、维生素合成、免疫调节及病原抑制等方面发挥着重要的作用，研究证明，胃肠道微生物的生态位竞争与定植菌所产细菌素有关[20]。例如，粪肠球菌产生的Bactofencin A(杆菌肽A)或Bacteriocin 21(细菌素21)能杀灭多重耐药菌[20]，并能调节肠道菌群间的生态位竞争。

幽门螺杆菌感染可引起胃炎、胃溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤及胃癌等多种疾病的产生。乳酸菌可以产生抑制幽门螺杆菌的多肽类物质。Sujitra Techo等[21]从泰国传统发酵米粉“Khanom-jeen”中分离到32株乳酸菌，15株菌株对临床分离的幽门螺杆菌有抑菌活性，耐胆汁酸的发酵乳杆菌P43-01对幽门螺杆菌MS83和BK364菌株有广泛的抗菌活性。这些拮抗效果与对α-糜蛋白酶和胃蛋白酶敏感的蛋白质化合物相关。这为临床治疗顽固性的幽门螺旋杆菌感染提供了新的思路。

此外，乳酸菌细菌素对万古霉素耐药肠球菌[20]、肠道沙门菌、单核细胞增多性李斯特菌[22]也有一定的抑制作用。这也一定程度上为临床治疗相关感染性的疾病提供了新的方向。但需注意的是，由于细菌素为多肽、蛋白类大分子物质，其能多大程度穿过肠-血液屏障到达特定部位发挥生物活性[23]，是阻碍其应用的一大问题。

3.3 细菌素在其他疾病中的应用

Nisin作 为研究得最深入的细菌素，已成功用于牛乳腺炎的治疗，其在人体的应用目前已引起关注。一项为期两周的研究[25]证明了其用于女性乳腺炎治疗的潜力：8位葡萄球菌乳腺炎患者(已接受2～4周抗生素治疗，但病情未改善)随机分为两组，一组 接受Nisin溶液治疗，另一组接受不含Nisin的溶液治疗。实验第一日，两组患者葡萄球菌菌落计数相似；但是到实验d14，接受Nisin治疗组的平均菌落计数明显低于不接受Nisin治疗组。Nisin在治疗人乳腺炎的初步成功预示细菌素用于人乳腺炎等皮肤软组织感染治疗有一定的可能性。

此外，Fu等[26]应用下颌骨骨折术后感染动物模型表明，从植物乳杆菌分离的细菌素，能显著减少生物被膜菌的数量和减少炎症因子的产生。一定程度上证明细菌素有可能是在控制术后感染方面发挥作用。

4 细菌素的应用限制及解决方法

大部分细菌素抗菌谱仅限于与产生菌亲缘关系较近的病原菌，抗菌谱较窄，这是限制细菌素运用的主要不利因素之一。通过不断地努力，目前也发现不少具有广谱抑菌活性的细菌素，不仅能抑制革兰阳性细菌，对革兰阴性细菌也有抑制作用。如植物乳杆菌CMCC-P0002产生的细菌素[27]对金黄色葡萄球菌等革兰阳性细菌和铜绿假单胞菌等革兰阴性细菌均有抑制活性。部分细菌素甚至能抑制原生动物、真菌、病毒等细菌外微生物[28]。有研究者尝试通过与其他抗菌药物联用、与螯合剂联合等方式扩大细菌素的抗菌谱。由于不同的抗菌机制，Nisin与某些抗生素联用有协同作用[3]，抗菌谱扩大到革兰阴性菌[29]；Durancin 61A(杜兰辛61A)与万古霉素的混合物对MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，ATCC 700699)有协同作用，FIC(Fractional inhibitory concentration，部分抑 菌浓度指数)值为0.3[30]。

细菌素目前分离纯化困难，限制了其产量。细菌素的产生由相关基因控制，其中结构基因可能位于质粒或染色体上，也可能并存于质粒和染色体。其产量除了受遗传控制外，还与温度、pH、培养基组成等环境因素有关[31-32]。乳酸菌生长的营养环境成分复杂，不仅增加了分离纯化的难度，也增加 了生产成本。根据细菌素的理化性质进行分离纯化，大致分三步[33]：第一步粗分离，初步除杂；第二步中度纯化，大量除杂；第三部精制，一般采用反相高效液相色谱法。这一系列纯化过程复杂，而且细菌素回收率很低、纯度不高，即使是Nisin也难买到其高纯度产品。在单菌种发酵中细菌素的产量一般较低，但通过与其他菌种共培养可以提高产量[34]，如有研究表明戊糖片 球菌与植物乳杆菌共培养的细菌素产量高于戊糖片球菌单菌种培养的细菌素产量。对细菌素的发酵条件、纯化过程进行优化，提高细菌素产量和回收率、降低生产成本，使其适于工业化生产是科研者一直在探究的问题。也有研究者尝试通过构建基因工程菌来增加细菌素产量，通过酵母表达系统、乳酸杆菌表达系统等实现了细菌素的异源表达。

5 结语

全球细菌耐药形势愈发严峻，寻找新的抗感染思路具有重要意义。细菌素具有对人体无毒、低免疫原性及不易产生抗药性的特点，部分细菌素还具有耐酸、耐高温、抗菌谱广等特点，存在成为抗菌药物替代品的潜力。虽然目前Nisin是世界上唯一商品化的细菌素产品，主要用于食品防腐，但目前细菌素的研究和应用正在向医疗卫生领域扩展[35]。在口腔感染性疾病如牙周病、龋齿，胃肠道感染性疾病如幽门螺旋杆菌感染所导致的胃炎、胃溃疡等疾病，以及乳腺炎、骨折术后感染等方面，相继有研究证明细菌素的有效性，这些研究为细菌素的抗感染治疗可能性提供了依据。但因细菌素自身的局限性，如分离提纯困难、产量低，大部分细菌素抗菌谱较窄，且细菌素为大分子物质可能不易透过各种人体屏障发挥作用，导致要让细菌素在临床感染方面发挥较大的作用，还有相当遥远的路程。未来尚需更多、更深入的研究。