生物钟相关基因参与高血压的机制

王欣婷 袁晓晨

高血压是心脑血管疾病最主要的危险因素，控制高血压是当前心脑血管疾病预防的有效切入点和关键措施[1]。随着新的治疗理念——时间治疗学的不断发展，基于生物钟的计时型干预受到关注。生物钟由两个连锁的转录/翻译反馈环(TTFL)产生，核心TTFL由4种整合蛋白驱动，即2种激活因子(CLOCK与BMAL1)和2种抑制因子(PER与CRY)，以及调节这些整合时钟蛋白定位和维持其稳定性的激酶和磷酸酶。其中，CLOCK与BMAL1作为核心转录因子，可形成异源二聚体激活PER、CRY基因以及其他控制时钟输出基因的转录。当PER和CRY被翻译后，二者相互作用进入细胞核，与CLOCK和BMAL1相互作用抑制下一步的转录激活；当PER和CRY蛋白通过泛素依赖途径降解时，对CLOCK和BMAL1的抑制作用解除，循环便重新开始，以此产生24 h的基因表达模式[2]。血压存在昼夜节律变化，本文介绍可对血压进行调节的生物钟基因。

1 BMAL1基因

BMAL1也称MOP3或ARNT3，属于碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)-PAS域转录因子家族，是产生昼夜节律分子振荡器的关键组成部分[3]。BMAL1基因位于11号染色体短臂，由20个外显子组成[4]，可协调15%的基因转录组进行节律性表达[5]。在大鼠中，已发现编码BMAL1的基因位于高血压易感位点，来自人类全基因组广泛关联(GWAS)的研究也证实，BMAL1基因的rs6486121位点与高血压相关性较高[6]。据一项来自10 796名欧洲血统个体的GWAS数据分析表明，BMAL1附近的rs6486122位点与冠状动脉疾病和2型糖尿病发病有关，特别是与血浆凝血酶原抑制剂-1(PAI-1)的表达水平显著相关[7]。Leu等[8]在对参与生物钟调节的11个基因共23个单核苷酸多态性(SNPs)进行分型后，发现BMAL1的rs3816358位点与372例年轻高血压患者的发病显著相关。

BMAL1在血压调节中发挥重要作用。在敲除BMAL1后，小鼠表现为血压、心率下降，活动节律完全丧失，呈现出持续的低血压状态[9]。研究表明，除了平滑肌中的BMAL1能够参与调控血压[10]，血管周围的脂肪组织(PVAT)作为脉管系统的独特功能层，也参与了不良血压表型的发展，其BMAL1的缺失不仅降低了小鼠静息期的血压，还可导致超杓型血压[11]。目前，BMAL1参与超杓型血压的机制可能为以下几点：(1)BMAL1基因敲除小鼠体内血管紧张素原的表达水平降低，改变了血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在平滑肌细胞中表达的昼夜节律性；(2)BMAL1基因敲除小鼠肾脏钠水排泄的昼夜调控能力受损[12]；(3)BMAL1-KO(BMAL1敲除)小鼠可出现内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的耦合转换功能障碍，eNOS解偶联增加，相关内皮调节基因Nox4昼夜节律表达异常，导致过氧化物增加，内皮损害加重[13-14]。同时，心肌细胞生物钟基因的中断对心脏结构和代谢产生不利影响。在小鼠心肌细胞中特异性敲除BMAL1基因，小鼠表现出昼夜间平均动脉压变异性增大，胰岛素介导下的心肌葡萄糖利用率降低，进一步引发胰岛素抵抗、蛋白质合成增加，促进心肌肥大与重构[15-16]。

BMAL1还参与了血管和内皮病变，在动脉硬化、血管重构以及内皮功能等方面均有作用。研究显示，BMAL1的选择性缺失上调了组织金属蛋白酶抑制剂4(TIMP4)的表达，对发生腹主动脉瘤的小鼠有有效的血管保护作用[17]。Shang等[18]发现，当血流状态改变时，BMAL1突变小鼠对血管变化的敏感性降低，其内皮功能调节因子丝苏氨酸蛋白激酶(Akt)、eNOS的正常节律性表达模式消失，从而引发内皮功能障碍。这表明生物钟可能是生物力学和时间传感器，在协调时间、血流动力学和内皮功能上起到了重要作用。

2 CLOCK基因

人类CLOCK基因位于4号染色体长臂，含有20个外显子，且其内含子、外显子的组成与小鼠一致。研究表明，CLOCK基因是哺乳动物近日节律的调控者，同时也是最早被发现和鉴定出的生物钟基因。作为核心时钟基因的一员，CLOCK可与分子伴侣BMAL1特异性结合，形成异源二聚体进一步促进PER和CRY基因的表达[19]。1998年，Katzenberg等[20]首次发现了CLOCK的1个单核苷酸多态性位点(SNP)，即CLOCK基因的3′UTR突变处(3111C/T)，此SNP与“夜晚型”节律相关，随后Mishima等[21]在2005年进一步证实了这一发现。Bandín等[22]对超重女性展开研究，发现3111C位点与昼夜节律紊乱和睡眠模式改变有关，进一步表明CLOCK位点突变有导致肥胖倾向的可能。在动物实验中，CLOCK突变小鼠也呈现出肥胖及高脂血症的特点[23]。CLOCK参与调节高血压的昼夜节律，出现该基因突变的小鼠可表现出心脏和肾脏多个器官的功能改变。当小鼠的心肌细胞发生特异性CLOCK突变时，CLOCK无法结合DNA，进而无法激活节律靶基因[24]。在肾功能方面，肾脏对水和电解质的排泄呈现明显的昼夜节律，当CLOCK发生突变时，小鼠可出现轻度尿崩、尿钠排泄增多和血压明显降低[25]。CLOCK突变通过多种机制引起血压改变，可能与血浆醛固酮水平降低以及心脏、肾脏、主动脉等组织中外周基因的昼夜表达改变有关[26]。

3 PER家族

PER蛋白的磷酸化是昼夜节律的关键调节器[27]。PER家族通过抑制肾素-血管紧张素系统广泛参与高血压的发病。临床降压措施中普遍提倡低盐饮食原则，研究发现在生物钟基因发生紊乱的条件下，这一原则似乎并不适用。特别是在PER基因敲除后，长期慢性低盐饮食不仅可引起非杓型高血压，还会进一步加重血管内皮损害[28]。

3.1 PER1基因

研究发现，PER1的丢失增加了小鼠对高盐摄入及盐皮质激素治疗的敏感性，给予PER1基因敲除雄性小鼠高盐饮食及盐皮质激素时，小鼠平均动脉压显著升高，且出现非杓型高血压[29]。此外，Documa等[30]证实，在同等饮食条件下，PER1基因敲除小鼠也表现出类似的血压表型改变，且PER1在调节心血管节律时呈现性别依赖，雄性小鼠主要表现为非杓型高血压，在雌性小鼠中给予高盐饮食及盐皮质激素则对PER1介导的非杓型高血压有保护作用[31]。研究表明，肾钠调节依赖机制有助于阐述血压的昼夜节律，肾钠转运基因对PER1依赖性盐敏感型血压及非杓型血压至关重要，其机制考虑为PER1参与调节了肾脏中钠转运相关基因上皮钠通道(ENaC)和氯化钠协同转运蛋白(NCC)等的表达。其中，NCC、ENaC和无赖氨酸激酶(WNK)参与了盐敏感型高血压的发病。在远端肾小管中，NCC主要受到WNK的调节，参与肾钠的重吸收。在PER1敲除小鼠中，正常调节钠转运的基因表达受抑，导致小鼠尿钠排泄出现夜间/白天比值显著降低，而远端肾单位NCC和ENaC的转录显著增加，促进非杓型高血压的形成[30,32]。Hernandez等[33]发现，在外周组织中，PER1、11-β-羟基类固醇脱氢酶2(11βHSD2)和上皮钠通道亚单位(αENaC)等基因的表达均受到醛固酮不同程度的影响，提示在慢性醛固酮暴露(DOCA)或盐敏感性高血压时，醛固酮可改变PER1的表达情况。此外，PER1还可影响其他肾钠调节基因的表达，当PER1表达减少时，α-上皮钠通道和FXYD5(具有钠钾ATP酶活性的正调节因子)表达下降，caveolin1、Ube2e3和内皮素-1 (ET-1，肾钠再吸收的抑制剂)表达增加。其中ET-1是上皮钠通道和血压的调节因子，可激活内皮素受体ETA和ETB来调节血压，而肾脏中PER1是ET-1的抑制因子，敲除后可导致肾皮质和髓质中ET-1水平升高，产生升压效应[34-35]。

3.2 PER2基因

研究表明，在哺乳动物的3个周期基因(PER1、PER2、PER3)中，只有PER2基因参与了核心时钟机制[36]。PER2中的rs6431590位点与年轻高血压患者的非杓型血压显著相关[8]。Hou等[37]发现，PER2在外周组织中的异常表达与糖尿病患者血压节律受损相关。此外，肥胖引起的血浆纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)水平升高被认为是心血管疾病的危险因素，而PER2可通过下调PAI-1的表达独立于代谢紊乱来减轻肥胖症引起的纤溶不良[38]。虽然破坏生物钟基因后，小鼠容易出现类似代谢综合征的表现，但与BMAL1突变小鼠相比，PER2突变小鼠血压较低，且没有血脂异常，这表明PER2突变引起的内皮功能障碍与代谢危险因素无关，而与PER2基因相关。PER2影响内皮功能的机制可能为：(1)PER2可调节内皮依赖性血管舒张，当PER2发生突变时，内皮细胞的Akt信号转导增加，血管衰老加速；(2)促进新生血管生成的内皮祖细胞(EPC)动员受阻，导致缺血诱导的血管重建受损[39]。研究发现，维持PER2稳定可作为治疗心肌缺血的潜在策略。PER2敲除可造成梗死面积扩大，缺血后的心脏保护功能丧失。腺苷受体2b(Adora2b)信号转导可在心肌缺血期间维持PER2稳定，有利于糖酵解酶的转录诱导和缺血引起的PER2依赖性心脏保护，维持心脏代谢稳定，改善局部缺血耐受[40]。

3.3 PER3基因

PER3基因位于人类染色体的1p36，共21个外显子，第18个外显子区域存在4个或5个重复序列，称为可变数目串联重复序列(VNTR)，每个VNTR可编码18个氨基酸[41]。研究表明，PER3中VNTR多态性与多个表型参数有关，包括昼夜偏好、睡眠稳态、感染和癌症等[42]。PER3等位基因VNTR是易受完全睡眠剥夺和昼夜节律失调影响的遗传标记，根据等位基因VNTR数目不同可分为PER3 4/4(具有4个VNTR)、PER3 5/5(具有5个VNTR)2种纯合体和PER3 4/5杂合体。其中，人群中约有10%的基因型为PER3 5/5纯合体，该基因型表现为早起偏好，在完全睡眠剥夺的情况下，大脑在执行任务时会出现更严重的反应降低与认知衰退[43]。睡眠剥夺的发展会导致心率变异性降低和交感神经活动增加，这是心血管事件的预测因素[44]。Lipkova等[42]研究了PER3基因对314例急性ST段抬高型心肌梗死患者疼痛发作时间的影响，发现携带PER3 VNTR多态性不同基因型和不同等位基因频率的急性心肌梗死患者，在发病时间上存在明显的昼夜节律差异；尤其是在男性中，PER3 4/5、PER3 4/4两个基因型与PER3 5/5基因型相比，疼痛发作的昼夜节律存在显著差异，PER3 VNTR可能与心脏功能调节以及心肌梗死进展的个体差异有关。台湾学者对133例阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)患者和11名健康人进行对照研究，分别在4个时间(6∶00、12∶00、18∶00、24∶00)采集外周血，测定白细胞中9个核心时钟基因的表达，发现PER3和CRY在24∶00时的联合表达可能是预测OSAHS及严重程度的潜在因子[45]。但也有研究认为，PER3多态性不是慢性心力衰竭的主要危险因素，对射血分数、纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级、高脂血症和2型糖尿病等不具有预测功能[46]。虽然PER家族被认为是心血管功能的调节因子，但目前PER3与血管的关系仍不够明确，值得进一步研究。

4 CRY基因

哺乳动物的昼夜节律基于负反馈通路，其中隐花色素CRY1和CRY2对其他生物钟基因的转录抑制作用是该机制的核心，并可进一步反馈抑制转录激活因子CLOCK和BMAL1的表达。CRY1作为有效的转录抑制因子，可单独维持细胞的昼夜节律[47]。研究表明，CRY1/CRY2基因敲除小鼠存在盐敏感性高血压，CRY1/CRY2可通过增加肾上腺特异性限速酶3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)的表达来调节醛固酮的生成，导致醛固酮合成异常增高[48]。其机制主要为：血管紧张素Ⅱ在人肾上腺皮质H295R细胞中通过转录因子神经生长因子诱导蛋白B(NGFIB)诱导3β-HSD3B1产生，其中3β-HSD的亚型HSD3B6仅在生成醛固酮的细胞中表达，是小鼠发生高血压的危险因素。CRY缺失可造成3β-HSD mRNA和蛋白质表达水平升高，3β-HSD酶活性增强，醛固酮的生成增加[49-50]。CRY主要通过调节α-肾上腺素能受体介导的外周血管收缩，参与血压的昼夜变化[51]。CRY基因敲除小鼠可出现高血糖[52]。Tanida等[53]发现，在糖尿病小鼠中，CRY1的过表达可降低血糖并增加小鼠对胰岛素的敏感性，其机制主要与CRY控制糖异生中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1)和葡萄糖6-磷酸酶(G6PC)有关[54]。因此，CRY在2型糖尿病的血糖控制以及盐敏感性高血压的发病中起到了重要作用。

目前，临床中仍有较多高血压患者存在血压不达标和昼夜节律异常，此类人群的心血管预后相对较差，仅调整给药时间难以实现理想的血压控制。了解生物钟基因的整体表达差异是控制血压节律的有效措施，以生物钟基因作为药物治疗靶点，模拟正常昼夜节律，改善不良血压表型，将是未来血压调控以及心血管不良事件防治的重点和新方向。