参与肝组织再生修复的肝细胞分布特征

刘雅雪 汪艳

肝脏组织具有特殊的再生能力。在肝组织中，肝小叶通常被划分为汇管区、移行区和中央静脉区。位于不同区带的肝细胞具有不同的基因表达谱、代谢活性和染色体特性等。不同区带肝细胞之间是否再生能力不同，仍未知。

关于肝组织的再生修复机制，一直存在多种学说。如 “流动肝脏”学说认为，靠近汇管区的肝细胞与其他区带的肝细胞相比具有更强的增殖能力；在正常肝脏更新过程中，新生肝细胞产生于汇管区，随后逐渐向中央静脉区迁移并不断成熟[1]。Lorup[2]采用放射自显影技术实验验证了该学说，发现汇管区肝细胞具有较高的增殖能力。但也有实验结果质疑该学说，如Bralet等使用逆转录病毒载体特异性标记并追踪肝细胞分布变化，发现表达β-半乳糖苷酶的肝细胞移植到肝脏后在相同位置停留1年以上，并没有从汇管区向中央静脉区流动的迹象[3]。另一方面，目前普遍认为，生理条件下的肝组织稳态是通过成熟肝细胞分裂维持的，干细胞/祖细胞表型细胞对此贡献很少。在损伤的肝组织中，可检测到具有祖细胞表型(LGR5+、Sox9+、CD133+)的细胞，但常驻干细胞/祖细胞对肝细胞数量维持和功能修复的整体贡献很少。

近期各种新型的谱系追踪工具、分析技术和新的数据报道不断涌现。AXIN2作为Wnt/β-catenin通路重要靶分子，是多种组织中成体干细胞的重要标识。已有学说认为，中央静脉区AXIN2+肝细胞是维持肝组织稳态的再生肝细胞来源。然而最近，Sun等[4]采用细菌人工染色体(BAC)载体转基因AXIN2技术造模，减少以往模型中由于干预内源性AXIN2基因而可能产生的AXIN2表型不足的问题；使用该小鼠模型，研究者发现恢复肝组织稳态的增殖肝细胞来自肝小叶各区，而非仅来自中央静脉周围的AXIN2+肝细胞，转录组和功能学分析显示，AXIN2+和AXIN2-肝细胞具有相同的增殖能力。Halpern等[5]通过应用单细胞转录组测序(scRNA-seq)技术，结合组织稳态下情况下的小鼠肝脏空间重构，显示了从汇管区到中央静脉区，肝细胞AXIN2表达逐渐增加而Sox9表达逐渐减少。其中值得注意的是，增殖相关基因如Ki67和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达程度并未随空间分布出现变化。这些结果支持Sun等[4]的研究结论。

基于对Rosa26-Rainbow Cre报告杂合子小鼠尾静脉注射AAV8-TBG-Cre载体的技术方法，Chen等[6]采用随机谱系追踪策略观察肝细胞的命运变化，发现在肝组织稳态维持过程中，存在着广泛分布的肝细胞克隆，而非流向汇管区的大片肝细胞。而且大多数肝细胞克隆是多倍体，提示中央静脉周围AXIN2+双倍体肝细胞的增殖能力有限。还有一些研究观察到在肝组织稳态维持过程中，不同分区的多倍体肝细胞中高表达端粒酶反转录酶的肝细胞可以衍生出不同大小的肝细胞克隆。这些研究目前都不支持之前关于中央静脉区AXIN2+肝细胞是维持肝再生的细胞来源的观点。

肝细胞倍性也是肝再生机制研究的一个重要话题。已知多倍体肝细胞的出现频率会随着年老和很多长期疾病状态而增加，但是这类肝细胞在肝再生中的作用还不清楚。为了观察肝再生中的肝细胞倍性增多和倍性减小现象，Matsumoto等[7]构建了多色报告基因小鼠模型，通过谱系追踪发现在损伤后的肝再生过程中，多倍体肝细胞能够进行增殖并减少倍性，并且在植入亚急性肝衰模型小鼠进行肝脏组织重建的过程中，这些倍性降低的子细胞在后续分裂过程中又可以恢复多倍体状态。该研究提示，多倍体肝细胞是慢性肝损伤肝组织再生的主要细胞来源。

不仅肝组织稳态维持过程中，多种肝损伤引发的再生修复过程中也发现增殖肝细胞在肝小叶的各分区广泛分布。为了追踪肝再生过程中的单个肝细胞，Chen等[6]和Matsumoto等[7]在实验中使用低剂量的腺病毒载体追踪，发现在以中央静脉区损伤为主的情况下，增殖肝细胞克隆绝大多数分布在中央静脉区；而在以汇管区损伤为主的情况下，增殖肝细胞克隆绝大多数分布在汇管区。这些数据提示，肝组织存在一个损伤后的局部补偿性修复机制，表现为再生过程中局部AXIN2和LGR5表达上调以及多倍体细胞的倍性调整。

这些新发现对于我们理解肝脏病理生理变化，尤其是纤维化组织重塑和慢性肝病癌变具有重要意义。虽然肝细胞增殖似乎是由肝组织各处分布的局部损伤信号引起，并依赖于肝细胞倍性状态和组织损伤类型，但是某些肝细胞亚型对这些增殖信息的反应似乎更敏感。近5年来逐渐广泛采用的scRNA-seq技术，在鉴定正常和患病肝脏中未知的细胞类型和亚型，研究稀有细胞(例如肝祖细胞)以及非实质细胞在慢性肝病和癌症中的作用具有独特优势。基于scRNA-seq的数据分析发现，正常肝脏中存在不同亚型的肝细胞，该现象归咎于肝小叶不同分区以及营养和氧气交换供应的差异。这些基于scRNA-seq定义的不同亚型肝细胞在损伤修复反应中的作用如何？是否存在易致癌变的细胞亚型？这些都值得深入探究。scRNA-seq技术在肝非实质性细胞的表型分析方面也有大量新数据。如最新研究中定义了具有新表型标志的肝窦内皮细胞亚群、纤维化相关肝内巨噬细胞亚群、纤维化相关肝星状细胞/及成纤维细胞亚群，以及肝癌组织中与特殊微环境相关的上皮细胞和基质细胞亚群等。总之，这些scRNA-seq数据提示我们，关于肝组织中时空关系和细胞相互作用等因素在肝再生过程中的作用机制，还有更多重要信息等待研究者们不断认识和清晰还原。

最新研究则证明，作为肝再生细胞来源的肝细胞广泛分布于肝小叶的各个分区，这些肝细胞的增殖特征可能取决于各种肝损伤过程中局部肝组织的特殊信号。随着新技术持续涌现和模型不断进步，将会揭示更多肝再生的机制。