孕中期与孕晚期羊水细胞培养方法的差异性研究

闫梅 陈佛兰 叶建翔

惠州市第一妇幼保健院，广东 惠州516007

羊水中因存在胎儿细胞，使得羊膜腔穿刺术抽取羊水进行染色体分析成为可能，随着孕周的增加，羊水内有活性的胎儿细胞相对减少，培养成功率有所下降，但对大孕周羊水的培养仍然具有一定的价值。本研究拟在孕中期羊水细胞培养方法的基础上，对孕晚期的羊水培养方法进行改进，目的在于提高孕晚期羊水细胞培养的成功率，给临床错过有效检查时机的孕晚期孕妇提供一个补救的方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2015 年5 月至2018 年7月来产前诊断中心进行遗传咨询并具有产前诊断指征的孕妇2303 例，年龄（29.8±8.4）岁，孕周（19.4±3.3）周。在孕中期穿刺（16～27W）的孕妇2218 例，在孕晚期（28～38W）穿刺的孕妇85 例。

1.2 方法

1.2.1 孕中期羊水培养方法。羊膜腔穿刺无菌抽取20mL 羊水，分别注入2 支无菌的15mL 刻度管内，1600r/min 离心弃上清，将沉渣分别接种在2 瓶装有4mL 培养液的培养瓶内，37℃5%的CO2培养箱内培养7 天观察细胞生长情况后换液，再放入培养箱内继续培养直至收获。

1.2.2 孕晚期羊水培养方法。羊膜腔穿刺无菌抽取20mL 羊水，分别注入2 支无菌的15mL 刻度离心管内，1600r/min 离心弃上清，由于孕晚期羊水离心沉渣过多，接种时适当弃掉一部分沉渣再接种到装有4mL 培养液的培养瓶内用力吸打悬液，一周后换液，无论是否有细胞贴壁，均将换下来的细胞培养液悬液重新接种到一个新的培养瓶内，加入半量的新鲜培养液并用力吸打多次，然后再放入培养箱内静止培养，定期在相差显微镜下观察细胞的生长情况，待细胞克隆达到满足一个低倍镜大小，数量在3 个以上时即可传代直至收获。

1.2.3 收获。培养瓶内克隆传代后，每天相差显微镜下观察细胞生长情况，待细胞生长密度达到70%以上，培养瓶内圆亮细胞较多的情况下，滴加100μg/mL 的秋水仙素2 滴，3h 后即可收获，制片，G 显带。

1.2.4 核型分析。以ISCN2013 为核型分析诊断标准，计数在2 个独立培养的培养瓶中平均分布的20 个以上中期分裂相，分析5 个以上核型，当出现2 个或2 个以上细胞系时增加细胞计数，鉴定嵌合情况。

2 结果

孕中期的2218 例羊水，培养成功2217 例（99.9%），有1 例因为羊水沉渣偏少，贴壁细胞不能形成有效的细胞连接，而培养失败；85 例孕晚期羊水培养成功84例（98.8%），其中1 例使用孕晚期特用的分瓶培养但无羊水细胞贴壁，84 例培养成功的孕晚期羊水中发现7例异常核型，其中21 三体2 例，18 三体一例，4 例为平衡易位，已经通过检查父母核型，确认为父母来源的异常。

3 讨论

目前，羊水细胞培养进行染色体核型分析仍然是产前诊断诊断染色体病的主要手段，影响羊水细胞培养成功率的因素很多［1］，其中孕周的选择是非常重要的因素，最适合的孕周为18～24W［2］，本研究显示，在孕16～27 周因细胞数量适中，细胞活性较好，常规的细胞接种，培养，传代，收获都能收获较完美的核型进行分析，但是超过28 周后羊水有型成分增多，常较浑浊，含有较多的死细胞，杂质偏多，经常出现无细胞贴壁的情况，导致培养失败。

尽管孕晚期脐血培养具有相对简单，发放报告时间短等优点，但由于穿刺水平的限制及对脐血穿刺的恐惧及风险的不确定性，本院对于孕28～36 周的具有产前诊断指征的孕妇，均抽取羊水进行染色体检测的病例，其中有部分病例由于进行脐带血穿刺失败而改为了进行羊膜腔穿刺抽取羊水继续进行核型分析。

本研究显示，如果用孕中期培养细胞的方法用于孕晚期的标本，孕晚期的标本则出现了无细胞贴壁生长的情况，即使有细胞贴壁生长，但是细胞克隆偏少而且克隆偏小，克隆周边细胞生长偏慢且过于紧实，细胞易老化，传代后细胞生长缓慢，生长不均匀，易聚拢，收获后核型少而且短小，本研究发现7 天换液后将换下的4mL 悬液重新加入到新的培养瓶内，并分为两瓶，每瓶在补充2mL 新鲜培养液，用力吸打几十次，重新放入培养箱内静止培养，一般第3 天开始就会有新的细胞开始贴壁，一周后在相差显微镜下观察，就会见到有明显的细胞克隆，生长方式与孕中期细胞相似，收获核型多且有部分核型能达到G 显带400～550 条带，可能因为孕晚期羊水内的成分较孕中期的复杂，胎儿脱落的表皮鳞状上皮细胞，胎脂，胎粪过多，而有活性的羊水细胞随着孕周的加大而变少，离心后沉渣较多，与孕中期同样的方法进行羊水细胞培养出现细胞密度过大，有活性的羊水细胞无有效的空间进行贴壁，同时胎脂等油性成分沉淀到培养瓶底部，影响细胞的有效贴壁，而7 天后将换下的细胞悬液重新分瓶并换入新的培养瓶重新进行接种后，减少了胎脂的成分及对细胞进行了稀释，活性的羊水细胞贴壁生长并形成有效的细胞克隆。张志强等［3］研究认为，通过大力吸打也可起到相同的效果，可能大力吸打细胞后，包裹在细胞表面的胎脂油性等成分会减少，利于细胞的贴壁生长。这种方法也存在一定的缺陷，由于存在二次培养，所以细胞培养的时间增加，报告的发放时间相对延长，对于孕周偏大的孕妇，存在报告时间与胎儿预产期的冲突，对于这样的病例快速处理，实验部分结束后马上阅片发放报告，发现21 三体两例，18 三体一例，平衡易位4 例，其中有1 例孕36 周，B 超发现了严重畸形，而提前引产，染色体分析证实为18 三体综合征，由于孕妇未及时关注围产期的孕检，产前筛查等，发现存在产前诊断指证时已经超过了有效的检测时间，又不能常规的进行脐血穿刺，因此对于孕晚期的孕妇能有效地进行羊水染色体核型分析，同样能有效地预防染色体病患儿的出生，降低出生缺陷的发病率。