王浆酸对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

牛佳卉,袁 静,张慧芳,贾金玉,韩 雪,吴梦颖,张 萌,赵 文

(河北农业大学食品科技学院,河北省农产品加工工程技术中心,河北保定 071001)

王浆酸即10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxydec-2-enoic acid,10-HAD),是蜂王浆中特有的一种具有独特生理生物活性的物质,在鲜蜂王浆中含量为1.4%(2.0%左右,其占蜂王浆总脂肪酸比重的55%以上[1]。研究发现[2],王浆酸具有增强免疫力[3-4]、抗菌消炎[5-8]、抗肿瘤[9-10]、抗辐射[11-12]、抗抑郁[13]等功效。

由饮酒造成的急性酒精性肝脏损伤也是现代凸显的社会主要病症。长期的酗酒或大量的饮酒会损伤人体的健康,可能会导致人体内器官、系统衰竭,造成一系列的健康问题[14]。根据世界卫生组织的数据表明,2016年全球所有死亡人数中5.3%归因于酒精,其中欧洲因酒精导致的死亡人数最多可达到10.8%[15]。酒精性肝损伤是由于酒精在机体内,通过引起氧化应激导致氧化产物增加,诱使脂肪在肝脏聚集,发生脂质过氧化反应和炎症反应,导致肝细胞进一步发生炎症、坏死、纤维化和硬化[16]。目前酒精性肝损伤已成为仅次于病毒性肝炎的第二大类肝病,且酒精对肝脏的损伤缺乏特异性药物[17],而现今市售保肝药物[18],如糖皮质类固醇、多烯磷脂酰胆碱、美他多辛等绝大多数的治疗效果不明显,而且往往具有副作用。因此,开发出安全有效的食品或保健品并通过营养干预预防酒精性肝损伤具有重要意义。

王浆酸具有明显的生理活性,前期已研究发现王浆酸具有一定的缓解急性酒精中毒的功效,因此本研究通过建立小鼠急性酒精性肝损伤模型,研究王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠肝功能和血脂水平、肝脏抗氧化水平和机体酒精代谢情况的影响,并观察其肝脏的组织病理学变化,来评价其护肝作用及初步探究其作用机制,为相关理论研究和王浆酸功能性食品的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

王浆酸(纯度≥99.9%) 石家庄维奥生物技术有限公司;水飞蓟宾胶囊 天士力制药集团股份有限公司;雄性ICR小鼠 72只,体重18～22 g,由河北省实验动物研究中心购入,许可证号:SCXK(冀)2014-12-003;无水乙醇、甲醛和HE染液 天津市科密欧化学试剂有限公司;甘油三酯、总胆固醇(TC)、极低密度脂肪蛋白(VLDL-C)、低密度脂肪蛋白(LDL-C)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)、一氧化氮合酶(TNOS)、超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、还原型谷胱甘肽(GSH)、单胺氧化酶(MAO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)检测试剂盒 南京建成生物技术有限公司。

Scientz-ⅡD超声细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司;1500-823型全波长扫描酶标仪 Thermo Scientific公司;SPX-250B型生化培养箱 北京鑫骉腾达仪器设备有限公司;3-18R型低温高速离心机 湖南恒诺仪器有限公司;RM2235型组织病理切片机 德国Leica公司;4590型石蜡包埋机 日本SAKURA精密技术公司;CKX41型倒置荧光显微镜 日本Olympus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立及剂量设计 小鼠酒精性肝损伤模型建立:雄性ICR小鼠72只,适应性喂养3 d后,按体重随机分为阴性对照组、模型对照组、王浆酸低、中、高(33、66、99 mg/kg·bw)剂量组和水飞蓟阳性对照组(35 mg/kg·bw),每组12只。阴性对照组和模型组用蒸馏水进行等体积灌胃,连续灌胃30 d。试验结束时,模型组、阳性对照组及王浆酸各剂量组用50%(v/v)乙醇造肝损伤模型,灌胃量14 mL/kg·bw,阴性对照组用蒸馏水代替,造模后禁食不禁水16 h。

1.2.2 动物处理及样本采集 末次给药造模后,将各组动物禁食16 h,然后称重记录体重。采用摘眼球取血法,采集小鼠血液样本,分离血清,-80 ℃冰箱保存备用。然后颈椎脱臼法处死动物,解剖取其肝脏并称重记录,取部分肝脏制成10%肝组织匀浆,3000 r/min离心5 min取上清待测。剩余肝脏放置10%的甲醛溶液中固定,进行病理组织形态学检查。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 肝脏指数 采用1.2.2中造模禁食后小鼠的体重和解剖后肝脏的质量进行肝脏指数的计算。

肝脏指数(mg/g)=肝脏质量/小鼠体重

1.2.3.2 血清生化指标的测定 取血清,严格按照试剂盒说明书测定TG、TC、VLDL-C、LDL-C、AST、ALT、ADH和ALDH等生化指标。

1.2.3.3 肝脏生化指标的测定 称取适量小鼠肝脏组织,按质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入9倍体积的生理盐水,制成10%的肝匀浆,然后4000 r/min,离心10 min。取上清液严格按照试剂盒说明书测定SOD、MDA、GSH-Px、GSH、MAO、TNOS、iNOS、ADH和ALDH等生化指标。

1.2.3.4 肝脏病理组织学检查 将固定在10%甲醛中的肝脏,进行石蜡包埋切片、常规的苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色[19]后,于光学显微镜下观察肝组织的病理学变化。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠体重及肝脏指数的影响

肝脏指数能够直观反映肝脏健康状况,由表1可知,与阴性对照组比,模型组肝脏指数极显著降低(P<0.01),说明模型组小鼠造模成功。与模型组比,虽然王浆酸低、中剂量组的肝脏指数无显著性变化,但各剂量组和阳性对照组的肝脏指数均有所上升,肝脏均受到不同程度的缓解作用,且高剂量组和阳性对照组存在显著性差异(P<0.05),说明王浆酸具有缓解酒精性肝损伤的作用。此结果与魏芬芬等[20]关于枸杞多糖对小鼠酒精性肝损伤的保护作用及机制研究结果表现一致,表明肝脏指数随护肝作用的增强而增加。

表2 王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠血清脂质的影响Table 2 Effects of royal jelly acid on serum lipids in mice with acute alcoholic liver

表1 王浆酸对酒精急性肝损伤小鼠体重 和肝脏指数的影响Table 1 Effect of royal jelly acid on body weight and liver index of mice with alcoholic acute liver

注:与阴性对照组相比,*:差异显著,P<0.05,**:差异极显著,P<0.01;与模型对照组相比,#:差异显著,P<0.05,##:差异极显著,P<0.01;表2～表7同。

2.2 王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠生化指标的影响

由表2可知,与阴性对照组比,模型组小鼠血清中TC、TG、LDL-C、VLDL-C的含量均极显著上升(P<0.01),表明摄入过量的酒精能够引起脂代谢紊乱。与模型组比,除低剂量组VLDL-C的含量显著性降低(P<0.05),其余各剂量组和阳性对照组血清脂质指标含量均极显著降低(P<0.01),高剂量组的降脂效果同阳性对照组相近。TG、TC、VLDL-C、和LDL-C常作为肝功能的辅助参考指标[21]。当肝脏出现纤维化或者肝硬化时,其血脂指标一般表现为TG、TC、VLDL-C、LDL升高,HDL降低[22]。本实验结果同啜文婷等[23]研究结果相同,说明王浆酸具有调节小鼠血脂代谢,缓解脂质代谢紊乱的作用。

表3可知,与阴性对照组比,模型组小鼠血清中AST和ALT活性极显著升高(P<0.01)。与模型组比,王浆酸各剂量组和阳性对照组的AST和ALT活性极显著降低(P<0.01),其活性随王浆酸剂量的升高而降低,且高剂量组的护肝效果最佳与阳性对照组效果相近。AST和ALT是广泛应用于检测肝损伤的指标[24]。罗安玲[25-26]等报道,大量饮酒后,肝脏受到酒精及其代谢产物的毒性影响,细胞膜通透性改变,导致肝细胞胞浆内AST和ALT进入到血液中,造成血清中活性升高。这与本实验模型组血清中AST和ALT活性显著性升高的结果一致。本研究发现王浆酸能够降低AST、ALT的活性,这与张建军[27]等的研究结果相同,说明王浆酸具有降低急性酒精性肝损伤小鼠血清中AST和ALT活性的作用。分析其降低酶活性的原因可能是因为王浆酸具有保护细胞膜的功能,能够调节细胞膜的通透性,使其通透性恢复到正常状态,维持细胞器基本结构的生态稳定,从而减少了肝脏细胞中AST和ALT这两种酶流入血液,表现为血清中两种酶的活性随着王浆酸剂量的升高而降低。

表3 王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠血清ALT 和AST活性的影响Table 3 Effects of royaljelly acid on serum ALT and AST activity in mice with acute alcoholic liver

2.3 王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠机体酒精代谢的影响

由表4知,与阴性对照组比,模型组小鼠肝组织中ADH活性都显著升高(P<0.05)，ALDH活性极显著升高(P<0.01)。与模型组比,王浆酸各剂量组和阳性对照组的ADH活性都极显著升高(P<0.01);对于ALDH活性,王浆酸低剂量组无显著性变化,而中、高剂量组和阳性对照组都极显著升高(P<0.01)。

表4 王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏ADH 和ALDH活性的影响Table 4 Effect of royal jelly acid on the activity of ADH and ALDH in liver of mice with

表5 王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠血清ADH 和ALDH活性的影响Table 5 Effect of royal jelly acid on serum ADH and ALDH activity in mice with acute alcoholic liver

由表5可知,与阴性对照组比,模型组小鼠血清中ADH和ALDH酶活力均极显著升高(P<0.01)。与模型组比,王浆酸低、中剂量组血清中ADH和ALDH酶活无显著性变化,但高剂量组ADH酶活显著升高(P<0.05),ALDH的酶活极显著升高(P<0.01);阳性对照组ADH和ALDH的酶活均极显著升高(P<0.01)。综合分析,王浆酸对于解酒作用的功效,高剂量组效果最佳。

乙醇脱氢酶氧化体系是肝脏分解代谢外来酒精的主要方式,其中起到关键作用的是ADH和ALDH[28]。ADH作为一种短链醇代谢酶,能将机体摄入的乙醇进行第一阶段的催化分解生成乙醛。而ALDH的主要作用是把乙醛催化为乙酸,再经过TCA循环最终生成CO2和H2O,消除酒精对肝脏的损伤[29]。

表6 王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏抗氧化能力的影响Table 6 Effect of royal jelly acid on antioxidant capacity of liver in mice with acute alcoholic liver

表7 王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏MAO、TNOS、iNOS活性的影响Table 7 Effect of royal jelly acid on the activity of MAO,TNOS and iNOS in liver of mice with acute alcoholic liver

本实验从血清和肝脏组织两个角度对ADH和ALDH进行检测分析,结果发现小鼠一次性大量摄入酒精后,机体产生自然应激反应代谢分解酒精以缓解对肝脏的损伤,模型组和剂量组肝脏内的ADH和ALDH活力会明显升高,并与剂量成正相关。本结果与白美美[30]对连翘叶茶保肝作用研究中表现出来的结论一致,分析原因可能是由于王浆酸具有辅助性刺激肝细胞进行乙醇代谢的催化作用。

2.4 王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织抗氧化能力的影响

由表6可知,与阴性对照组比,模型组的SOD、GSH-Px活力和GSH的含量极显著降低(P<0.01),而MDA含量极显著增加(P<0.01),说明模型组的肝脏抗氧化能力减弱。与模型组比,王浆酸各剂量组和阳性对照组的GSH-Px、SOD活力和GSH含量极显著增加(P<0.01),而MDA含量极显著降低(P<0.01)。

SOD和GSH-Px是机体主要的抗氧化酶,MDA是脂质过氧化的产物,能反映机体的脂质过氧化程度,间接反映细胞损伤的程度[31-32]。当摄入过量的酒精时,会造成肝细胞发生脂质过氧化,生成过量的氧自由基造成氧化应激,最终促进脂质氧化过程[33]。从结果可看出王浆酸能够增加GSH-Px、SOD活力和GSH含量,减少MDA的含量,因此王浆酸有一定的抗氧化能力,能够缓解肝细胞脂质过氧化进程,起到对肝脏的保护作用。

由表7可知,与阴性对照组比,模型组小鼠MAO活力极显著升高(P<0.01),TNOS和iNOS活力极显著降低(P<0.01)。与模型组比,王浆酸各剂量组和阳性对照组的MAO活力极显著降低(P<0.01),而除低剂量组的TNOS活力无显著性变化,其余各组TNOS和iNOS活力极显著增加(P<0.01)。说明王浆酸具有良好的护肝效果,且与剂量成正相关。

有研究表明,MAO参与胶原代谢,使胶原和弹性硬蛋白结合,形成胶原纤维导致肝脏纤维化,是评价肝脏损伤的重要指标[34-35]。NO具有舒张血管、抑制血管平滑肌的增殖和中性粒细胞浸润等功能,但其又能生成具有毒性的过氧化亚硝酸盐,导致组织损伤[36-37]。常用NOS指标来反映NO,而NOS在机体内分为nNOS、eNOS和iNOS,当组织受到损伤时iNOS会产生应激效果,使其活力升高,iNOS活性升高会引起NO的合成增加[38]。从结果可看出王浆酸能够降低MAO的活性,提高TNOS和iNOS的活性来达到护肝的效果。其护肝途径可能是通过iNOS活力的升高,带动NO含量的提高,NO可以舒张血管,加快血液循环,加速酒精代谢产物CO2和H2O的排除,辅助起到护肝的效果。

2.5 王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏病理组织形态的影响

由图1可知,阴性对照组小鼠肝脏结构清晰,肝小叶排列整齐,肝细胞以中央静脉为轴心呈大致辐射状排列。模型组的肝细胞索紊乱,肝细胞肿胀呈气球样变,胞质疏松,胞质内能够观察到脂肪空泡和水样变性且大小不等、数量不一,多个坏死在小叶内发生呈现点状或灶型,炎细胞侵入到汇管区中数目众多。王浆酸低剂量组肝脏组织情况与模型组情况近似。王浆酸中、高剂量组肝组织情况均有明显缓解,肝细胞胞质较为紧密,脂肪空泡和水样变性数量明显减少,小叶内坏死程度明显降低,汇管区有少量炎细胞侵润。阳性对照组肝组织有明显的治愈效果,肝脏组织结构清晰,肝小叶排列基本整齐,肝细胞呈正常多边形,胞质内脂肪空泡和水样性变数量较少。

图1 王浆酸对急性酒精性肝损伤 小鼠肝脏组织的病理学影响(HE,400×)Fig.1 Pathological effect of royal jelly acid on liver tissue in mice with acute alcoholic liver injury(HE,400×)

3 结论

王浆酸对急性酒精性肝损伤小鼠的肝脏具有保护作用,王浆酸能够升高肝脏指数,同时降低血清中TC、TG、VLDL-C和LDL的含量,降低血清中AST、ALT活性来达到其护肝作用,并且王浆酸中、高剂量组能够有效减少肝脏组织中脂肪空泡和水样变性情况的发生,维持肝细胞正常生态生理结构的稳定。通过王浆酸能够促进ADH、ALDH的分泌,提高SOD、GSH-Px、TNOS、iNOS活性和GSH的含量,降低MDA的含量和MAO的活性,初步探究其护肝机制可能是通过对肝脏细胞因子进行辅助调节,加速酒精代谢分析,减少脂质过度积累,从而降低一次性大量酒精摄入对肝脏造成的损伤程度,并且若长期服用王浆酸还可有效地增强肝脏抗氧化能力。但王浆酸的作用时间和护肝效果是否存在相关性,还有王浆酸的调节细胞因子的具体通路,还需要进一步试验验证。以上结果说明王浆酸具有护肝功能,为其功能性食品的进一步开发利用,提供了一定的理论依据。