隔药饼灸对慢性支气管炎模型大鼠外周血中T细胞亚群的影响❋

罗 明，阳仁达，谭 静，李双艳，言 芳，孙 璐，兰 伟

(湖南中医药大学研究生院，长沙 410208)

慢性支气管炎(chronic bronchitis CB)简称慢支，是气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症。临床以咳嗽、咳痰为主或伴有喘息，是呼吸系统常见疾病，中老年人发病较高[1]。慢支的治疗西医以抗感染及止咳平喘为主[2]，中医则根据辨证或以汤药内服或以针灸外用[3]。研究表明[4-5]，慢支的发生发展与机体免疫密切相关。一方面，免疫功能的减退为炎症的产生提供了便利条件；另一方面，在炎症状态下，免疫失衡将进一步促进炎症的发展。针灸作为中医疗法的重要组成部分，几千年来为民生健康做出了重要贡献。隔药饼灸作为针灸疗法的一种，临床运用较为广泛[6]。本课题的前期研究表明，隔药饼灸能增加慢支大鼠外周血中免疫球蛋白的含量[7]，但是否对外周血中T淋巴细胞亚群有影响尚不明确。本研究通过观察隔药饼灸对慢支模型大鼠外周血中T细胞亚群含量的影响，进一步探讨隔药饼灸治疗慢支的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康SPF级SD大鼠48只，体质量200～250 g，随机分为空白组、模型组、隔药饼灸组、核酪口服液4组各12只，雌雄各半。上述动物由湖南中医药大学动物实验中心提供(动物合格证编号SCXK(湘)2017-0003)，分笼饲养于湖南中医药大学实验动物中心，饲养温度20～25 ℃，湿度50%～70%(动物饲养环境实验室合格证号SCXK<湘>2009-0001)。

1.2 主要试剂及仪器

戊巴比妥钠(Biotobbed)；淋巴细胞分离液(华美生物)；红细胞溶解液(华美生物)；大鼠CD3-APC(eBioscience)、CD4-PE(eBioscience)、CD8a-PE-Cyanine 7(eBioscience)、单抗(Sigma)；流式细胞仪(LSRII型，美国Becton Dickinson)；低速离心机(LD5-10B型，北京京立)；“神灸300灸”艾炷(型号：东方1型)。

1.3 模型制备方法

参考有关文献[8]采用改良烟熏法复制慢支大鼠模型。造模时将大鼠置于特制的1×1×1 m的烟室中，刨花、锯末、烟叶各50 g点燃熏烟，每日2次，每次30 min，持续30 d。模型成功的标志为大鼠厌食、咳嗽、气喘、呼吸困难、蜷缩少动、精神萎顿、瘦弱、体毛枯槁、行动迟缓等。另显微镜下可见，大鼠气管黏膜上皮细胞增生，纤毛数目减少，纤毛变短，气管黏膜的纤毛倒伏、脱落，支气管壁炎细胞浸润，支气管平滑肌增厚、断裂。

1.4 隔药饼灸干预方法

选穴：Ⅰ组：肺俞、肾俞；Ⅱ组：关元、足三里。定位参照十二五规划教材《实验针灸学》[9]。

玉屏风散药饼制作：黄芪、白术(炒)、防风按2∶2∶1的比例称取，所用中药材由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供。上述诸药烘干、粉碎后过200目筛，装瓶备用。使用时将药粉用生姜汁调和成糊状(药粉和姜汁的比例约为10∶7)，制成厚约2～4 mm、直径为1±0.2 cm的药饼。

施灸操作：于造模后的第1天先用100 g/L硫化钠对大鼠施灸部位进行脱毛。选定穴位后，将药饼敷于穴位皮肤并用胶布固定，然后将去除隔热纸垫的艾柱放于药饼上点燃施灸，待艾炷燃完且余热散尽再换另一壮，每穴连续灸6壮(20 min)，每日1次，Ⅰ组、Ⅱ组穴位隔日交替施灸，连续治疗2周。在隔药饼灸组干预过程中，其余组大鼠予以捆绑束缚于鼠板上。

1.5 给药方法

于造模结束后第1天起称取大鼠体质量，核酪口服液组按照0.2 ml/10 g给予核酪口服液灌胃，每日1次，连续2周。空白组、模型组和隔药饼灸组同时灌以生理盐水，其剂量、次数、天数与核酪口服液组相同。

1.6 取材及指标观察

实验期间，密切观察大鼠的一般状态如体质量、毛色、精神状态等。待治疗结束，禁食不禁水12 h后摘取眼球，眼眶采血2 ml 加入抗凝管中用于流式检测。

1.6.1 气管、肺组织病理切片观察 采血后处死大鼠，剖取4组大鼠气管和右肺组织，置于4%的甲醛溶液中固定24 h，按照85%乙醇-95%乙醇-无水乙醇的梯度进行脱水，脱水后石蜡包埋，4～5 μm标准进行切片，HE染色，于光镜下观察各组大鼠气管及肺组织的病理学变化。

1.6.2 外周血T细胞亚群含量测定 检测时，取24 h内外周抗凝血100 μl 加入流式管底部；分别加入FITC标记CD8单抗和PE标记CD4单抗，室温避光15 min。加入红细胞裂解液，混匀后避光10～15 min，1000 r/min离心5 min弃上清液。加入PBS液500 μl清洗2次，1000 r/min离心5 min弃上清液。加入PBS液500 μl重悬细胞，流式细胞仪检测，通过FACS Diva6.0分析软件获取分析结果。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 一般状态观察

图1显示，通过生存状态积分评定来评价造模后各组大鼠生存状况。5分：正常大鼠饮食如常，无咳嗽、气喘、呼吸困难，活动自如，反应灵敏，体毛光滑顺泽；4分：大鼠出现食量稍减少，咳嗽，无气喘，无呼吸困难，反应稍迟钝，体毛欠光滑顺泽；3分：大鼠食量减少，咳嗽、气喘、无呼吸困难，反应迟钝，体毛竖立；2分：大鼠食量剧减，咳嗽、气喘、轻度呼吸困难，瘦弱，毛枯，行动迟缓；1分：大鼠极度厌食，咳嗽、气喘、中度呼吸困难，蜷缩少动，精神萎顿，体毛枯槁；0分：大鼠死亡。成模后开始干预，各组大鼠生存状态计分。

图1 各组大鼠生存状态积分比较

图1显示，在观察时间内各组均未见大鼠死亡。成模后，模型组、隔药饼灸组、核酪口服液组的生存状态积分均下降；与空白组比较，模型组自成模后生存状态积分一直波动在1～2分之间，差异显著(P<0.01)；干预9 d后，隔药饼灸组、核酪口服液组生存状态积分明显高于模型组(P<0.05)；干预14 d后，与模型组比较，隔药饼灸组、核酪口服液组生存状态积分均显著增加，同时隔药饼灸组显著高于核酪口服液组(P<0.05)。

2.2 气管和肺组织病理形态观察

图2显示，正常组大鼠支气管纤毛排列整齐，无炎性细胞浸润，支气管壁平整，支气管黏膜结构完整，上皮细胞无变性坏死和损伤，肺泡无扩张，无炎症细胞浸润。模型组大鼠肺泡扩张，炎症细胞浸润，气管黏膜层及黏膜下层大量炎症细胞浸润，管腔内有脱落细胞，与空白组比较肺及气管组炎症浸润明显。隔药饼灸组大鼠肺内支气管及肺泡正常，散在少量炎症细胞，气管黏膜层及黏膜下层正常，少量散在的炎症细胞提示经隔药饼灸后肺及气管组织黏膜已修复，炎症得到基本控制。核酪口服液组大鼠肺泡形态正常，巨噬细胞增多；气管黏膜下层有弥漫性淋巴细胞浸润，管壁完整且无脱落,提示经过核酪口服液治疗后肺及气管也正在修复，免疫细胞活跃，对炎症细胞进行吞噬。

图2 各组大鼠肺(×100倍)及气管(×250倍)病理形态学观察比较

2.3 各组大鼠外周血中T细胞亚群含量变化比较

表1显示，各组大鼠外周血中T细胞亚群含量变化比较，与空白组比较，模型组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+显著降低(P<0.05)；与模型组比较，隔药饼灸组、核酪口服液组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+明显升高(P<0.05)，说明2种治疗方法均有升高慢支模型大鼠T细胞亚群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+含量的作用；与核酪口服液组比较，隔药饼灸组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+升高更明显(P<0.05)。

表1 各组大鼠外周血中T细胞亚群含量变化

注：与空白组比较：★P<0.05；与模型组比较：▲P<0.05；与核酪口服液组比较：◆P<0.05

3 讨论

T淋巴细胞亚群是免疫系统的重要部分，T淋巴细胞与CD4+、 CD8+分子结合即产生2种亚群。研究表明[10]，慢支的发生发展与T淋巴细胞亚群变化密切相关。CD4+属于Ig超家族，为细胞膜表面的单链糖蛋白，是T淋巴细胞识别、活化与信号传导的重要免疫因子。其与MHCⅡ类分子非多肽部分结合，使T细胞抗原受体(TCR)与抗原肽-MHCⅡ类分子间的相互作用趋于稳定。另外，其参与细胞内信号传导作用，当CD4+因子含量降低时，炎症信号不能及时传与T淋巴细胞，导致T淋巴细胞无以识别炎症细胞。CD8+同属Ig超家族，为细胞膜表面的双链糖蛋白，其与MHCⅠ类分子非多肽区结合，作用类似CD4+因子[11]。

隔药饼灸是在直接灸基础上衬垫以中药制成的片状或饼状物作为传热介质的一种灸疗方法[12]。在合理选择穴位及药物后，隔药饼灸能发挥 “灸-药-穴”三位一体的作用。中医认为慢支的病位在肺，其根在肾，以虚为主。本研究选取肺俞、肾俞、关元、足三里，其中肺俞、肾俞为肺肾经气输注于背部的腧穴，可调节肺肾功能，与慢支病位相契合。关元自古以来为扶正要穴，研究表明[13]隔药饼灸关元穴可升高T细胞亚群中CD3+、CD8+细胞和细胞因子，以增强免疫功能。容贤冰等[14]研究发现，艾灸关元穴可上调外周血CD3+、NK、NKT细胞数量,使CD4+/CD8+比值稳定。足三里为保健强壮之要穴，自古以来针灸界颇为重视，其保健防身，提高免疫力的功效在现代基础研究中得以证实。高义森[15]发现，电针足三里可重建Th1/Th2平衡，改善由Th1介导的过敏性皮炎症状。薛小卫等[16]研究发现，针刺足三里可降低海马组织免疫细胞因子IgG1、IgG2a的表达,抑制癫痫发作,保护脑组织。

本研究药饼配方源自玉屏风散，该方出自《究原方》，由黄芪、白术、防风3味中药组成，具有益气固表、祛风扶正之功，是中医扶正固本的经典方剂。该方应用广泛，是国家基本中成药，被《中华人民共和国药典》所收载[17]。现代基础研究表明，玉屏风散可诱导肺气虚证大鼠淋巴细胞增殖，增强脾脏淋巴细胞活性，提高巨噬细胞活性,激发NK细胞活性[18]。玉屏风散通过调节细胞免疫功能,平衡Th1/Th2淋巴细胞亚群,抑制机体过敏反应，缓解变应性鼻炎大鼠的局部症状[19]。加味玉屏风散可降低变应性鼻炎大鼠体内免疫球蛋白E，产生抗过敏作用[20]。临床研究表明，玉屏风散辅以穴位贴敷能调理肺脾、固护卫表,增强反复呼吸道感染患儿免疫功能,减少呼吸道感染频次[21]；玉屏风散可提高机体免疫力，降低炎症因子水平，使慢性鼻窦炎患者临床症状得到明显改善[22]；玉屏风散可改善慢支病人的免疫状态，提高外周血中C3、C4、IgA、IgG及IgM含量，使体弱、易呼吸道感染患儿发病次数明显减少[23]。

本实验结果表明，隔药饼灸能改善模型大鼠的生存状态，改善肺及气管组织的病理变化，升高CD4+、CD8+、CD4+/CD8+，起到对免疫紊乱的调节作用。T淋巴细胞被激活后究竟是怎样进一步影响慢支大鼠的免疫系统，缓解气道炎症，相关的影响及机制仍需进一步研究。