浓香型白酒酿造过程中微生态群落的研究进展

张新红 张源 崔磊

摘  要：为探索浓香型白酒酿造过程中的微生态群落演替规律，对浓香型白酒酿造过程中的大曲、酒醅和窖泥等三大人工微生态系统中优势微生物种群进行了分析比较研究，结果发现，浓香型白酒酿造微生态系统存在不稳定性、开放性、目的性和可控性的特点，是酒类酿造中最为复杂的人工微生态系统，三大人工微生态系统之间相互协调，相互融合，完成复杂微生物代谢过程，对浓香型大曲酒生产技术的发展具有指导意义，为进一步提高浓香型白酒的质量和稳定性提供参考。

关键词：浓香型白酒  微生物  微生态  群落演替

中图分类号：TS262.3                            文献标识码：A                    文章编号：1674-098X（2020）08（b）-0066-05

Abstract： In order to explore the succession of microecological communities in luzhou-flavor liquor brewing process， the dominant microbial populations in daqu， fermented grains and pit mud in three artificial microecosystems were analyzed and compared. The results showed that the micro-ecological communities of brewing of luzhou-flavor liquor charactered with instability， openness， teleonomy and controllability are the most complex artificial micro-ecosystems in liquor brewing. The micro-ecosystems of Daqu， fermented grains and pit mud collectively complete the complex metabolic process of microorganism by coordination and fusion with each other. It has guiding significance to the development of brewing technique of luzhou-flavorliquor ， and which can provide reference for improvement of quality and stability of luzhou-flavorliquor.

Key Words： Luzhou-flavorliquor; Microorganism; Micro-ecological; Community succession

食品釀造历史悠久，源远流长，产品种类繁多，风味独特，以酒类酿造最具代表。除了世界著名六大蒸馏酒外，还包括黄酒、葡萄酒、啤酒、清酒等，它们大多为混合菌自然酿造。中国白酒在世界上独树一帜，酿造工艺独特，风味多样，按其风格特点可分为浓香、酱香、清香与米香4大基本香型，并由此衍生出兼香、凤香、特香、芝麻香等8种香型。其中，浓香型白酒具有“窖香浓郁、绵软甘冽、香味协调、尾净余长”的风格特点，受到广大消费者的青睐，这与其独特的酿造工艺密切相关。从某种角度讲，浓香型白酒酿造微生态系统是酒类酿造中最为复杂的人工微生态系统，它以“千年老窖，万年糟醅”为基础，经过长期的人工驯化，形成了特殊的酿酒微生物区系。对浓香型白酒酿造系统中复杂微生物系统及其生物学过程的研究，是阐明浓香型白酒风味、风格差异，提升生产技术水平，提高产品品质的基础，具有重要的理论和实践价值。

浓香型白酒酿造过程中存在着三大人工微生态系统，即大曲人工微生态系统、窖池人工微生态系统和窖泥人工微生态系统，可统称为酿酒人工微生态系统。该系统具有以下特点：（1）不稳定性，该系统易受各种外部因素的影响;（2）开放性，系统本身不能自给自足，依赖于外系统，并受外部的调控;（3）目的性，满足人类酿酒的需要;（4）可控性，可人工控制条件以满足发酵微生物的代谢需要。

在正常的人工酿酒微生态系统中，存在着严格的微生物群落演替过程和各种群间的共栖、共生、共酵的代谢调控过程。通过人为控制养分、温度、水分、氧气、pH、时间等环境因子，以“投其所好，抑其所恶”方式促进有益微生物生长代谢，以“抑其所好，投其所恶”方式抑制有害微生物生长代谢，促进与抑制并举，实现系统内菌系、酶系、物系三系流通，固、液、汽三相融合，物质、能量、信息三流运转[1]。三大人工微生态系统之间相互协调，相互融合，完成复杂微生物代谢过程，最终达到生产优质浓香型白酒的目的。

1  酿酒微生物分类研究

中国酿酒微生物研究自20世纪80年代至今一直是研究的热点。利用传统方法和现代分子生物学方法，研究者对酒曲、酒醅、窖池中的微生物进行了大量研究，初步解析了酒曲、酒醅和窖泥中的微生物种类、数量与群落结构，并对选育的大曲优良菌株和窖泥功能菌株进行了应用研究。表1列出了浓香型酿酒微生态系统中的主要微生物种属。

2  人工大曲微生态系统中的群落演替

人工大曲微生态系统是开放型的，因此大曲中的微生物区系组成与制曲环境中的微生物关系极为密切，由于养料、水分、pH、温度、氧分等环境因子是随着时间不断变化的，因此，大曲中的微生物群落的种群和数量也呈动态变化趋势。温度是制曲的关键因子之一，对大曲微生物群落演替起重要作用。

霉菌Monascus[2]、Rhizopus、Thermoascus、Amylomyces、Talaromyces[5]、Thermomyceslanugin、Aspergillusoryzae[3]、Wallemia、Rhizomucor[4]、Byssochlamys[6]、Absidia、Mucor[7]Absidia、Aspergillus、Neurospora、Mueor、Penicillium、Talaromyces、Talaromyces、Eurotium、Fomitopsis[9-12].

酵母Saccharomyces[5]、Pichiakudriavzevii[3]、Issatchenkia、Candida、Saccharomycopsis、Wickerhamomyces[4]、Kluyveromycesmarxianus[7] Saccharomyces、Sporobolomyces、Oosporidium、Brettanomyces、Citeromyces、Pachysolen、Hansenula、Dekkera、Endomycopsis、Saccharomycopsis、Issatchenkia、Endomyces、Trichosporon、Torulaspora;Saccharomycessp.、Debaryomyceshansenii、Candidapseudolambica、Issatchenkiaorientali、Saccharomycescerevisiae[9-12]].

細菌Staphylococcus、Weissella、Bacillus、Lactobacillus、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora、Brevibacterium[6]、Leuconostocmesenteroides、Escherichia、Pantoeaconspicua、Erwiniapyrifoliae[8]Lactobacillus、Weissella、Bacillus、Dysgonomonas、Ruminococcaceae、Comamonas、Staphylococcus、Pseudomonas、Lactococcus、Leuconostoc、Thermoactinomyces、Acetobacter[9-12] Pelotomaculum、Sedimentibacter、Sporosarcina、Psychrobacter、Syntrophomonas、Petrimonas、Lactobacillus、Tissierella、Acetivibrio、Proteiniphilum、Carnobacterium、Anaerolineaceae、Pseuclomonas、Lutispora[11-13，25-27]].

大曲的生产不仅是环境微生物富集、生长繁殖与代谢过程，随着制曲过程中环境因子的人为调控，还发生了菌群的演替与驯化，并在此过程中逐渐成为多菌系、酶系和多物系的载体[14]，为白酒的酿造提供糖化、发酵动力与产香动力。

浓香型白酒使用的主要是中温型和中高温型大曲。早期的研究认为，芽孢杆菌（Bacillus）是中高温大曲中的优势菌群，种类和数量均高于中温大曲。但近年来利用高通量测序技术研究发现，乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）在中温大曲与中高温大曲发酵过程中均是优势菌群[9-10]，而芽孢杆菌属在中温大曲、中高温大曲发酵10d左右才成为优势菌群之一[10-26]。在泸型酒中温大曲发酵过程中，嗜热子囊菌属（Thermoascus）、Thermomyces、假丝酵母属（Candida）、Wickerhamomyces是主要的优势真菌类群。其中假丝酵母属（Candida）、Wickerhamomyces是初期主要的酵母类群，但随着发酵的进行，其相对丰度在第4天至第10天迅速升高，而后持续下降[10]。而嗜热子囊菌初期（0～4d）相对丰度较低，但在发酵第4-10d，相对丰度迅速上升，而后逐渐降低。Thermomyces在发酵10d后相对丰度不断升高，至32d相对丰度达49.5%。根霉菌属（Rhizopus）、Trichosporon、Kodamaea和曲霉菌属（Aspergillus）是泸型酒中温大曲中的相对优势菌群。其中，曲霉属在前期（0-4d）相对丰度逐渐降低，而后迅速升高，而根霉菌属、Trichosporon、Kodamaea相对丰度在第6天达到最高，而后迅速降低至不足1%。对四川宜宾中高温大曲[22]、剑南春大曲真菌的研究同样显示，嗜热子囊菌属、Thermomyces、根霉菌属、假丝酵母属、曲霉菌属、根毛霉属（Rhizomucor）等是主要的真菌类群[5]，三者表现出较高的一致性。但对古井贡酒中温及中高温大曲的研究发现，曲霉菌属与Rhizopusoryzae是主要优势菌群，而嗜热子囊菌属、Thermomyces在高温大曲中占优势[4]。此外，古井大曲中存在一些特有菌群，如：Pantoeaagglomerans与Pantoeavagans，显示出不同地域与不同制曲工艺对大曲菌群的重要影响[15]。

此外，对制曲过程中微生物数量的研究发现，曲心中的细菌数量始终低于曲皮，但曲心中的细菌数量始终呈上升趋势，而曲皮中则呈现先上升后下降的趋势。与细菌类似，曲心中的霉菌数量始终低于曲皮，但曲皮中霉菌数量呈下降趋势，而曲心中则先上升后下降。在制曲过程中，酵母菌初期数量较多，但后期迅速下降，并在曲心中有少量残留，在曲皮中往往检测不到酵母菌[16]。而放线菌在整个制曲过程中呈下降趋势，并有向曲心转移的趋势。而不同制曲工艺的调控措施及其引起的曲坯理化性质差异是影响大曲微生物菌群结构及多态性的重要原因[17-18]。

经过大曲生料富集培养和环境选择，大曲内微生物发生了定向演变，新曲再经过3～6个月的储存，使菌种得到进一步纯化，酶活力得到钝化，酵母数量也进一步减少，储存过程中在酶和非酶作用下，进一步积累风味物质及前体，酿制出的酒香味更好。曹振华等[19]对泸型大曲中微生物、生理生化指标与曲香之间的关系进行研究发现，酸度、淀粉转化率、氨态氮、芽孢杆菌数量和酵母菌数量与曲香呈极显著正相关;在适宜范围内，酸度、淀粉转化率和氨态氮含量越高，芽孢杆菌数量和酵母菌数量越多，曲香就越浓郁。

浓香型人工大曲生态系统今后的研究方向是进一步弄清微生物种类，群落结构，筛选主要功能微生物，对处于VBNC（存活但无法培养）状态微生物的功能，可借用现代分子生物学研究方法进行量化研究。

3  酒醅人工生态系统中的群落演替

酒醅微生物菌群是浓香白酒酿造过程中另一个重要的人工生态系统。参与白酒酿造过程的酒醅微生物主要来源于大曲和环境，酒醅微生物区系同样是随着发酵时间变化的多种微生物交替演变的动态过程。在此过程中，酒醅微生物的菌群演替与代谢过程与窖池微环境相互作用，不仅决定着微生物群落的演替轨迹，还形成并积累了丰富的代谢产物，为浓香型白酒酒体风格的形成奠定了重要的物质基础。

胡晓龙等[20]对贾湖酒业酒醅微生物的群落演替规律，并对其在酒醅上层、中层和酒醅下层的空间分布进行了分析。结果显示，根据酒醅微生物的群落组成，可将发酵过程分为前期（0～7d）、中期（7～15d）和后期（15～60d）。在时间上，发酵后期微生物的物种多样性指数和丰富度指数均显著低于发酵前期。随着发酵的进行，前期的绝大多数优势属在7d后丰度显著下降，成为非优势菌群，而乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度则明显上升，成为发酵中后期占绝对优势的微生物类群。在空间上，上、中、下酒醅层内的物种多样性（α-多样性）与发酵时间具有显著相关性，但相同发酵时间节点下，各酒醅层内（α-多样性）及各酒醅层间（β-多样性）的微生物多样性不存在显著差异。

肖辰等[21]利用高通量测序技术，对泸型酒酒醅细菌群落的演替规律进行了研究，并运用相关性检测（Manteltest）对不同发酵阶段细菌的群落演替与环境因素变化的相关性进行分析。结果显示，通过聚类分析可将酒醅发酵过程划分为3个阶段：阶段I（0–5d），阶段II（6–17d）和阶段III（18–40d），且3个阶段的酒醅菌群结构差异显著。且温度、水分以及乙醇浓度对酒醅发酵前期（0–5d）细菌群落演替具有重要作用。

3.1 细菌数量的动态变化

发酵前期，由于氧气与营养条件好，细菌与芽孢杆菌迅速增殖，其中地芽孢杆菌（0～6d）是绝对优势细菌，但此后数量迅速降低，并在发酵6～15d逐渐被乳杆菌属替代，15d后乳杆菌属占细菌总数的79.7%～95.7%，成为绝对优势菌群[26]。此外，也有研究表明，发酵20d后细菌与芽孢杆菌数量有升高趋势，且芽孢杆菌在细菌中的比例逐渐增大，基本维持在103/g水平[23]。兼性厌氧细菌的变化趋势与好氧细菌的变化趋势基本一致。

3.2 酵母菌数量动态变化

发酵初期，酵母菌经历了快速增殖阶段，至发酵第9天可达105数量级，但随后数量逐渐下降，至发酵后期（45d～55d），酵母菌数量降至102/g-103/g水平，以地霉属酵母为主[23]。

3.3 霉菌数量动态变化

发酵前期，霉菌快速增殖，发酵第6天可以达到102个/g数量级。但在发酵中期，由于酒醅营养条件下降以及酒精浓度、酸度等窖池微环境的改变，霉菌迅速衰亡，发酵至20d，酒醅中已难以检测到霉菌[23]。

4  窖泥微生态系统的群落演替

窖泥微生态是浓香型白酒生产中最复杂的人工生态系统。窖泥中的微生物种复杂多样，且包含大量不可培养微生物，人们对窖泥微生物的研究远不如大曲微生物深入与全面。但对窖泥中重要的微生物类群，如甲烷菌、硝酸还原菌、硫酸还原菌与己酸菌等产氢菌之间“氢转移”的协同作用，以及己酸菌产香机制的认识均已经比较清晰。但對窖泥微生物的群落结构、种群关系及其与白酒风味及风味物质之间的关系仍是未来需要深入研究的重要课题。

浓香型白酒的酿造实践表明，窖池的窖龄直接影响白酒的风味与品质。这与窖池中的窖泥微生物种群及其长期的群落演替紧密相关。对河南“宋河酒”窖泥微生物研究发现，随着窖龄的延长，乳酸菌和喜热菌属（Caloramator）的相对丰度逐渐降低，而甲烷杆菌属（Methanobacterium）、甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）、短杆菌属（Methanobrevibacter）以及Syntrophomonas、Sedimentibacter、Clostridium等梭菌类群和放线菌的相对丰度逐渐增加[27]。对窖泥微生物的长期演替（1～50年）研究发现，新窖泥富含乳杆菌属细菌，由于乳酸的大量积累使适应性低的菌群被逐步淘汰。随着窖龄的增加，由于乳杆菌的衰亡和NH4+的增加，窖泥pH值也随之上升，拟杆菌门和螺旋体门（Spirochaetes）大量繁殖，细菌多样性增加，窖泥微环境中的有机酸、H2和CO2的含量也有所增加，促进了产甲烷菌（Methanogens）及己酸菌的生长。在成熟窖泥中，梭菌属IV簇、梭菌科和Anaerobrancaceae的丰度提高并与窖泥己酸含量呈显著正相关，细菌群落相对稳定[24]。钟姝霞[25]等将不同窖龄窖泥的微生物多样性与其理化指标进行相关性分析发现，微生物群落结构与窖泥中的有效磷、总酸、腐殖酸含量都具有显著相关性，是影响微生物群落演替的重要因素。

窖泥中微生物种群间的协同共存、相互作用所构成的窖泥微生物群落，从多方面影响窖泥及其酒醅发酵，从而决定浓香型大曲酒的质量和风格。认识和研究窖泥生态系统，对浓香型大曲酒生产技术的发展具有指导意义。

5  展望

浓香型白酒酿造微生态群落研究需要在以下几个方面加强研究。

（1）加强研究方法和研究手段的创新：建立实验室研究模型，在传统的研究方法和手段的基础上，引入分子生物学和微生态系统研究手段和方法，微观研究与宏观研究相结合。从基因水平上弄清种群的多样性和多态性，从微生态系统水平研究群落演替的规律，微生态系统的结构，并加强生态酿酒的研究。

（2）加强微生物代谢途径的研究：特殊的环境微生态必然存在特殊的微生物及独特的代谢途径或代谢支路，弄清大曲、酒醅和窖泥发酵过程中的各种物质变化与多种酶学反应的相关性，分析主要功能微生物与发酵过程的物质变化关系，特定生化代谢反应与曲酒风格和质量变化的相关性，有害微生物及有害代谢成分，可以为中国浓香型白酒的工艺改良和品质提高提供必要的理论依据和现实的技术基础。

（3）构建重要酿酒微生物资源库：三大人工微生态系统的微生物种群经历了长期的突变和人工驯化选择，蕴藏着丰富的有经济价值的微生物资源，是重要的微生物资源库，从中发现和发掘工业微生物有效菌株及其因，加以分析和保藏，可有效地保存和利用这些资源，并进一步把对有益微生物的利用从酿酒行业逐步发展到其他微生物工程领域。

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