链脲佐菌素诱导小鼠糖尿病肾病模型的建立

王友娣 王李卓 高家林

【摘 要】目的：构建糖尿病肾病小鼠模型。方法：选取120只健康雄性小鼠，随机分成对照组（n=50）和糖尿病肾病组（n=70），对照组采用正常饮食喂养，糖肾组予以高糖高脂饮食喂养加链脲佐菌素（STZ）腹腔注射。收集对照组和糖肾组小鼠血液、尿液和肾脏标本，测定血尿液生化指标，肾脏病理切片染色观察形态学改变情况，最终确定糖肾小鼠造模成功。结果：糖肾组小鼠随机血糖高达16.7mmol/l，尿蛋白呈阳性，血肌酐较对照组明显增高。病理切片染色显示糖肾组小鼠肾脏肾小球萎缩，肾小管基底膜增厚，肾脏纤维化水平明显升高。结论：高糖高脂饮食联合STZ腹腔注射是构建小鼠糖尿病肾病模型的有效方法。

【关键词】糖尿病肾病;血糖;血肌酐

【中图分类号】R692【文献标识码】A【文章编号】1005-0019（2020）01--01

全世界糖尿病发病率的增加伴随着糖尿病并发症的同时增加，包括视网膜病变、神经病变和肾病。在这些并发症中糖尿病肾病可能是最常见且危害最大的，导致大量的死亡率[1]。尽管近几十年来对糖尿病肾病的研究已经消耗巨大的公共卫生资源，但其分子发病机制仍不清楚，近20多年来还没有新的药物用于治疗糖尿病肾病[2]，此外，除了相对粗略的临床指标尿蛋白和血肌酐水平外，尚无可靠的生物标记物可在临床表现明显的糖尿病肾病发生之前对高危患者进行鉴别[3]。而在这些领域取得进展的一个重要障碍是缺乏有效复制人类糖尿病肾病主要特征的动物模型[4]。这种模型可以用来确定发病机制，确定药物靶点和试验新的治疗方法。小鼠由于其具有遗传易操作性，被广泛应用于临床模型中，包括糖尿病肾病（DN）[5]。本研究采用高糖高脂饮食喂养加STZ腹腔注射[6]诱导糖尿病肾病小鼠模型，通过生化指标以及肾脏形态学检测来判断小鼠糖尿病肾病模型是否构建成功。

一、材料与方法

1.实验材料：（1）实验动物：健康雄性C57/BL6小鼠120只，8周龄，体重25-30g，购买于南京青龙山动物场，由皖南医学院SPF级动物房专门饲养。（2）仪器：全自动生化分析仪（皖南医学院第二附属医院）;血糖仪（美国强生公司）;代谢笼（皖南医学院药理实验室）;冰冻切片机（美国Thermo公司）。（3）主要试剂：葡萄糖（西陇化工股份有限公司）;STZ（美国Sigma公司）;柠檬酸（上海生工生物工程股份有限公司）。

2.方法：选取120只健康雄性小鼠（8周龄，25-30g），随机分成对照组（50只）和糖尿病肾病组（70只）。适应性喂养一周后，分别称量对照组和糖肾组小鼠初始体重，提取小鼠肾脏、血液，进行病理切片和血生化指标检测。随后糖肾组小鼠给予高脂饮食喂养，对照组进行正常饲养。四周后称量并记录小鼠体重，留取24h尿液测量尿白蛋白、尿肌酐等生化指标。禁食12小时后随机选取对照组、糖肾病组小鼠各3只，测量小鼠空腹血糖，之后采用眼眶取血法取血，用以测量生化指标。剩余糖肾组小鼠给予腹腔注射小剂量的STZ（35mg/kg，1mol/L的柠檬酸缓冲液中，浓度为1%，PH4.5），诱导部分胰岛素缺陷，注射时间控制在30min内。对照组给予注射相同体积的柠檬酸缓冲液。之后糖肾组继续给予高脂饲料喂养，对照组正常饮食喂养。STZ注射后0-3周，每周称量小鼠的体重、记录体重变化。空腹状态下测量小鼠尾静脉血糖并留取24h尿液。当小鼠空腹血糖≥11.1mmol/L时，可初步认为糖尿病小鼠模型成功，留24h尿液后杀鼠取血，测量生化指标。待血糖≥16.7mmol/L后，且尿蛋白阳性可认为糖尿病肾病小鼠模型构建成功。

3.本次实验数据采用SPSS18.0软件处理，计数资料采用[n（%）]表示，行检验，计量资料采用（）表示，行T检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

二、结果

1.两组小鼠血生化指标比较：与对照组小鼠相比糖尿病肾病小鼠的空腹血糖、空腹HbA1c、肾脏指数均升高，血浆白蛋白下降，且具有统计学意义。

2.正常小鼠与糖尿病肾病小鼠肾脏形态学差异

接下来我们对糖尿病肾病小鼠肾脏进行形态学染色，分别采取了HE、PAS、MASSON、PASM染色，结果发现与正常小鼠相比较糖尿病肾病小鼠系膜细胞及基质弥漫性增生，肾小球萎缩硬化，肾脏纤维化程度明显。肾小球系膜增生系膜区隐约可见嗜复红蛋白沉积。肾小管上皮细胞颗粒变性或空泡变性。皮髓质交界区和肾盂黏膜见灶性淋巴细胞浸润。

讨论

目前，糖尿病肾病在全球发病率剧增，有研究预测至2035年全球的糖尿病患病人数将达到5.92亿，且糖尿病肾病是发达国家中与糖尿病相关的最常见并发症和死亡的主要原因。然而近几十年来，临床上尚无能针对性治疗糖尿病肾病的药物或其他治疗方法[2，7]。因此，探索糖尿病肾病的发病机制并研究出有效的药物治疗糖尿病肾病迫在眉睫。这些都需要建立可靠的糖尿病肾病动物模型，为研究提供实验基础。

动物模型可用于揭示人类疾病的发病机制，因为它们提供了临床研究中无法实现的精细实验策略[8]。根据美国国立卫生研究院资助的糖尿病并发症联合动物模型公布了一个糖尿病肾病啮齿动物模型的三个关键标准：①肌酐清除率从初始开始下降50%以上;②白蛋白尿（增高50倍）;③特征性病理改变，包括系膜基质的扩张，任何程度的小动脉透明样变，基底膜增厚和间质纤维化。在许多领域，包括糖尿病研究，小鼠可以说是人类疾病临床前研究的首选实验模型。选择小鼠模型的优点包括它们相对低成本，繁殖力强，妊娠时间短，最重要的是遗传操作的易处理性[9]。

本研究采用高糖高脂饲料喂养小鼠5周后低剂量STZ注射（35mg/kg，1mol/L的柠檬酸缓冲液中，浓度为1%，PH4.5）诱导小鼠部分胰岛素缺陷，待小鼠空腹血糖≥11.1mmol/l时可初步认为糖尿病模型构建成功，以后继续喂养高糖高脂饲料直至血糖超过16.7mmol/l，血生化检测出现大量蛋白尿，肾组织形态学染色提示系膜细胞和基质弥漫增生，肾小管上皮细胞颗粒变性、空泡变性，皮髓质交界区和肾盂粘膜见灶性淋巴细胞单核细胞浸润，均提示早中期糖尿病肾病模型形成，也表明高糖高脂饮食联合STZ诱导是构建糖尿病肾病小鼠模型的有效方法。糖尿病肾病的发生发展是一个慢性过程，一旦进入终末期肾衰将无法逆转，因此早中期糖尿病肾病的防治将尤为重要[10]。但国内外近几年对早中期糖尿病肾病治疗的研究仍未取得明显疗效，这其中一个重要原因便是缺乏能精确模拟人体糖尿病肾病重要特征的动物模型[11]。而本研究构建的早中期糖尿病腎病小鼠模型肾功能损伤较严重，且具有明显的肾脏病理特征，为糖尿病肾病的研究提供了稳定的实验基础。

參考文献

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