植物病原菌多聚半乳糖醛酸酶的研究简述

2020-03-02张小秋宋修鹏陈冠州王泽平雷敬超梁永检李杨瑞黄冬梅颜梅新

广西糖业 2020年4期

张小秋，宋修鹏，陈冠州，王泽平，雷敬超，梁永检，李杨瑞，黄冬梅，颜梅新

（1.广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所/中国农业科学院甘蔗研究中心/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室，广西南宁 530007；2.广西北海市蔬菜研究所，广西北海 536000；3.广西南亚热带农业科学研究所，广西崇左 532415）

植物细胞壁是抵御病原菌入侵的主要屏障。病原菌通过分泌一系列的细胞壁降解酶降解寄主植物的细胞壁，以突破屏障入侵寄主植物［1］。多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG；EC 3.2.1.15）是一种重要的细胞壁降解酶，广泛存在于细菌、真菌和植物中。PG通过降解植物细胞壁中的同源多聚半乳糖醛酸，使植物组织浸解，导致原生质体死亡，在病原菌侵染寄主引起病症过程中有着关键作用。PG是一种细胞壁结合蛋白，首次从致病真菌的离体细胞壁中获得，作用是催化果胶α-（1，4）多聚半乳糖醛酸的裂解［2］。

1 PG的分类与特征

PG是降解植物果胶骨架结构的主要酶之一。根据底物位置的不同，PGs可分为内切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）、外切多聚半乳糖醛酸酶（exo-PG）或鼠李糖半乳糖苷酶（olio-PG）。endo-PG能随机地从多聚半乳糖醛酸链内部消解α-1，4-糖苷键，产生聚合度为10-14的寡居半乳糖醛酸，对底物特异性较强。exo-PG能从寡聚半乳糖醛酸链的非还原末端消除单个半乳糖醛酸，产生聚合度逐步降低的寡聚半乳糖醛酸链和半乳糖醛酸单体，对底物特异性较弱［3］。endo-PG可降解细胞组织引起细胞死亡［4］，且产生的寡居半乳糖醛酸是激发植物防卫反应的激发子［5］。exo-PG可降解由endo-PG产生的激发子物质，并转变为其它细胞壁降解酶的诱导剂［6］。有学者认为复杂的endo-PG形式可能使病原菌增加降解效率、扩大寄主范围的能力［7］。

不同来源的PG序列具有很大的差异。细菌PG之间的相似性很低，但Erwinia carotovora病原菌中的两个endo-PG具有95.5%的相似性，其余序列间的相似性为11.7%～58.7%。相同作用方式的PG序列的相似性高于不同作用方式的PG序列。细菌exdo-PG间的相似性为29.1%～58.7%，endo-PG间的相似性为39.3%～95.5%。另外，同一物种不同作用方式的PG间的相似性也很低［8］。真菌PG序列之间具有较高的相似性，相似性大小范围在11.3%～100%，同一类型PG之间相似性较高，不同类型之间相似性很低，一般在10%～20%之间。真菌PG有多个完全保守的芳香族的氨基酸残基，endo-PG和exo-PG还有各自特异保守片段和残基［8，9］。据报道，PG的进化源于生态对策，是与植物的免疫反应协同进化的［10］。

多数真菌的PG是多基因编码的［11］，ORF编码区被内含子分隔，内含子最多可达7个。PG的前体蛋白N端信号肽一般为 7～16AA，个别如曲霉菌的PGC有一个较长的N端信号肽（40AA）。大多数真菌PG的分子量为20～60 kDa，等电点偏酸性［12］。

2 PG活性及致病性

不同病原菌的PG的理化性质不同。小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）PG在pH4～12范围内均具有活性，pH6.0时活性最大；对热不稳定及对胰蛋白酶和蛋白酶K敏感，对紫外线和氯仿亦敏感［13］。蟠桃褐腐病原菌（Monilinia fructicola）PG在28℃条件下活力最高，在pH 7.0时活性达到最高，培养5 d时的酶活力最高［14］。水稻病菌（Rhizoctonia solani）PG的产生受培养时间、温度、碳源、葡萄糖浓度和pH的影响，其活性受缓冲液pH和温度的影响。葡萄糖是PG的最适碳源，但葡萄糖浓度大于5%时，PG的产生受到抑制。当缓冲液50℃，pH5.0时，PG活性最高。PG遇强碱、强酸、氯仿、高热、紫外线、胰蛋白酶和蛋白酶K等均不稳定［15］。

PG是病原菌定殖寄主与产生致病性的必需因子。Jurick等［16］发现氯氮卓青霉菌（Penicillium solitum）PG在其侵染寄主的前期有着重要的作用；Li等［17］在毕赤酵母中表达辣椒疫霉（P.capsici）的PG体外重组蛋白，发现重组蛋白能侵染辣椒表现症状；Isshiki等［18］研究发现链格孢菌（Alternaria citr）endo-PG的突变降低了病原菌对柑橘和马铃薯的致病力。灰葡萄孢缺失Bcpg1后，其在不同寄主上的致病力下降［19］，麦角菌（Claviceps purpurea）endo-PG失活后，几乎丧失了对黑麦的致病力［20］，说明PG在病原菌产生致病力中起到重要作用。

PG活性对病原菌的致病力有影响。孙文秀［21］研究了大豆疫酶根腐病菌（Phytophthora sojae）中的PG活性对其致病力的影响，发现致病性菌株的PG活性明显高于非致病菌株的。王麒然等［22］测定了花生叶腐病菌（Rhizoctonia solani Kühn）离体条件下和活体内病菌分泌的细胞壁降解酶活性与变化，发现果胶酶中的PG酶活性强，感病花生品种中测得的细胞壁降解酶活性一般都比抗病品种高。莲腐败病菌在侵染寄主过程中可产生多种细胞壁降解酶，以PG活性最高，且强致病性菌株的PG活性显著高于弱致病性菌株［23］。李萍等［24］也发现PG活性的高低与辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）致病力的强弱相关，试验菌株接种辣椒苗复壮后的PG活性高于复壮前；强致病力菌株的PG活性明显高于弱致病力菌株。崔佳等［25］构建了玉米弯孢叶斑病菌（Curvularia lunata）Clpg1基因敲除突变体ΔClpg1，发现ΔClpg1突变体的PG活性降低，致病力减弱，说明Clpg1基因调控了玉米弯孢叶斑病菌的致病性。

PG的糖基化位点与其致病性有重要作用。通过预测发现PG的一级结构具有不同数量和类型的可能N-糖基化位点。李艳青等［26］突变了辣椒疫霉（P.capsici）PCIPG2 N-糖基化的3个潜在位点（N34、N76、N137），并表达了这些突变蛋白及测定其活性，发现N-糖基化在PCIPG2酶活性上起直接作用，使得PCIPG2酶在较低水平上保持较高的稳定性。单个的PCIPG2糖基化位点N34、N76、N137 对PCIPG2的致病性起正调控作用，而3个糖基化位点相互协调的功能抑制PCIPG2的活性，在PCIPG2表达致病过程中起负调控。曲霉（Aspergillus spp.）和寄生疫霉（P.parasitica）的PG利用N-糖苷酶F去糖基化后分子量降低，蛋白酶活性完全丧失［27，28］。

3 PG的表达调控

大多数真菌的PG属于分泌型胞外酶，有诱导物存在时才能分泌PG，果胶、聚半乳糖醛酸等均能诱导PG的分泌。但葡萄糖、Ca2+、PG抑制蛋白（PGIP）则抑制PG的分泌［29］。Aspergillus glavus的PG基因在含果胶培养基中被诱导表达，而葡萄糖却不能诱导其表达。Colletotrichum lindemuthianum侵染寄主后，其PG的转录活性迅速上升［30］。香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum）生理小种4和生理小种1在柑桔果胶或PGA提供碳源时，PG活性加强，以葡萄糖或CMC作为唯一碳源时，PG活性很低［31］。核盘菌（Sclerotinia.Sclerotio－rum）在1%橘皮果胶培养基中被诱导表达，PG活性不断提高，并在第7d活性达到最高［32］。PG基因可能与同家族内其他基因协同作用。许春景等［33］通过基因敲除技术，研究发现多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能与同家族内其他基因协同作用，通过调节果胶酶活性参与苹果树腐烂病菌致病过程。

4 PG基因的克隆表达

目前克隆表达了多种病原菌的PG基因。GarciaMaceira等［34］从番茄专化型F.oxysporum.f.sp.lycopersici（FOL）中克隆了pg5基因，推测其氨基酸为35 kDa，pI 8.3，过表达获得35 kDa具有活性的PG蛋白。李洋等［35］利用同源克隆技术克隆了马铃薯软腐病（Erwinia carotovora subsp.carotovora）peh基因，在原核表达中表达并测定得到其酶活性0.024 U·mL-1·min-1。赵艳琴等［36］克隆了烟草靶斑病菌的endo-PG1和endo-PG2的cDNA全长，序列分析表明endo-PG1和endo-PG2的推测蛋白均具有PLNO3003基因家族保守结构域，其跨膜结构间存在差异，表达受与烟草互作的诱导。吴伟怀等［37］首次从剑麻斑马纹病菌中获得了5个PG基因，并分别命名为Szpg1～Szpg5，均存在于被检测的剑麻斑马纹病菌中。龚鑫等［38］利用RT·PCR结合RACE方法克隆了莲腐败病菌的pg1全长cDNA，获得一个编码371个氨基酸的完整开放阅读框。在毕赤酵母表达系统中构建了PG1同工酶的真核表达载体，经甲醇诱导分泌出胞外蛋白PG1，分子量大小约为38kDa。由书妍等［39］表达了柑橘绿霉病菌（Penicillium digitatum）的PdPG2基因，PdPG2基因是酸性表达基因，其表达量随着pH升高而降低，pH3.0时表达量提高至对照的10倍，pH8.0时表达量下降至对照的0.36倍。刘震等［40］通过实时荧光定量PCR技术分析了玉米弯孢叶斑病菌PG基因（Clpg）在病原菌-寄主植物互作时期的表达情况，鉴定获得Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4基因，Clpg1基因的表达先升高后下降，Clpg2、Clpg3和Clpg4基因的表达逐渐上升。

5 PG活性的抑制

PG活性受到多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIPS）的抑制。PGIPS是病原真菌分泌的endo-PG的抑制剂。病原菌侵染过程中上调表达endo-PG基因，在某一阶段降解植物细胞壁以获取营养供自身营养［41］。为了抵御病原菌的PG，植物产生PGIPS与PG互作，过量表达的PGIPs激活茉莉酸代谢和β-1，3-葡聚糖酶表达，抑制水杨酸表达，引起细胞内信号转导、转录重组和防御代谢等合成表达，以抵御病原菌的入侵［42］。PGIP富含亮氨酸，与PG酶非竞争性地、特异性地结合，以抑制PG酶的活性，提高植物的抗病性。

PGIP的含量、分布差异与植物的抗病性有关。PGIP可能更多地在植物生长的幼苗期对病原真菌起防御作用。阮期平等［43］测定小麦品种的抗赤霉病性与PGIP含量和分布的关系，发现小麦品种对赤霉病的抗性越强，PGIP含量越高、分布越广；喷洒小麦禾谷镰于SW89-2589小麦品种的幼苗上，发现叶感病较为严重，其次是根，茎几乎不感病，PGIP在茎中的含量最高，其次是根，叶中最少；比较了抗病性不同的2个小麦品种，发现感病品种的PGIP含量较少，抗性较强的品种的PGIP含量较高。

PG活性受到儿茶素、酶类物质、韭菜汁、NO等的影响。研究表明儿茶素在棉苗对枯萎病抗性中的作用时，发现儿茶素可抑制枯萎病菌的菌丝生长、产孢及孢子萌发，对培养液中病菌的PG有抑制作用［44］。酚类物质对哈密瓜两种主要致腐病原产生的细胞壁降解酶活性的影响，发现邻苯二酚、对苯二酚、对羟基苯甲酸丁酯均能明显地降低匍枝根霉和半裸镰刀菌产生多聚半乳糖醛酸酶，对这些酶的活性也有明显的抑制作用［45］。杨静美等［46］测定了不同浓度的韭菜汁对香蕉枯萎病菌4号生理小种的PG影响，发现韭菜汁液浓度的增加对PG活性的抑制作用增强。吴斌等［47］研究发现，NO能抑制香蕉果实中PG的活性。