基于聚类分析的浓缩苹果汁风味品质分析与评价

柴鹏飞，李林洁，2，刘静，赵方圆，宋佳，郑宇，石磊，万守朋，王敏*

1(天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津科技大学 生物工程学院，天津， 300457)2(国家知识产权局专利局专利审查协作天津中心，天津， 300304)3(天津市利民调料有限公司，天津， 300308)

苹果是世界上种植量最大的水果之一，富含多种氨基酸、糖类、有机酸等营养成分，以及维生素、矿物质等微量元素[1]。浓缩苹果汁是以苹果为原料，经物理方法去除一定比例的水分获得的纯天然产品[2]。2016年，我国鲜苹果和浓缩苹果汁出口量分别为132.20万t和50.64万t，均居世界首位[3]。浓缩苹果汁主要用于饮料等食品的生产，虽然所有产品都符合《浓缩苹果汁》(GB/T 18963—2012)等相关国家标准[4]，但由于原料成熟度、生产管理等方面的原因，浓缩苹果汁批次间会存在风味差异，有可能会对其后续加工产品的风味品质产生影响。苹果汁的品质通常是依据《感官分析食品感官质量控制导则》(GB/T 29605—2013)及《感官分析方法学总论》(GB/T 10220—2012)等[5-6]相关标准来确定和检验苹果汁感官质量的，但感官评价存在着主观性强、差异性大、缺乏数据支撑等缺点[7]。

风味是评价食品品质特征的重要指标，通常人们所讲的风味主要是指味感和嗅感的综合[8-9]。其中，对味感产生影响的主要是食品中有机酸、氨基酸、糖类等不挥发性物质，对嗅感产生影响的主要是酯类、醇类、酮类等各种挥发性风味物质。目前已经鉴定出的苹果汁香气成分已有300多种[10]，主要包括酯类、醇类、醛类[11-13]，另含有少量酮类、烃类、酚类等物质。另外，有机酸、糖类等不挥发性物质也因其直接影响果汁的酸度、甜度等有着同样重要的地位。由于苹果汁中风味物质种类众多、组成复杂，且各类物质的来源并不能完全解析，给准确快速地判别浓缩苹果汁风味品质带来了诸多不便。

聚类分析(cluster analysis, CA)是一种用于分析多变量的技术[14]。其根据研究对象的多样性，将其分为相对同质的群组，并依据样品品质特性的相似程度将其聚合在一起，相似度大的优先聚合，最终按照类别的综合性质将多个品种聚合，进而完成聚类分析的过程[15]。此方法在农产品品种谱系、食品主成分及食品品质分析领域应用广泛。本论文采用风味化学分析方法，对同一年份和地区的浓缩苹果汁样品进行分析，筛选对浓缩苹果汁风味品质影响较大的风味物质建立其聚类分析方法，为浓缩苹果汁风味品质快速鉴定提供依据，也为生产企业优化工艺参数提供理论支撑和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浓缩苹果汁样品(2017和2018年榨季)，陕西某浓缩苹果汁生产企业；糖类、氨基酸、有机酸标准品(色谱级)，上海源叶生物科技有限公司；2-辛醇、H2SO4、醋酸钠、NaCl、DNFB、NaHCO3、KH2PO4、DNS试剂为分析纯，天津北方天医化学试剂厂；乙腈、乙酸为色谱纯，天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

CP1502电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；TDL-SC低速大容量台式离心机，上海安亭科学仪器厂；S20K pH计，梅特勒·托利多仪器有限公司；LH-T20手持折光仪，杭州陆恒生物技术有限公司；Agilent1100型HPLC仪，安捷伦科技有限公司；GC-789011型GC-MS，安捷伦科技有限公司。

1.3 样品的选取与分析

1.3.1 样品的选取

由厂家提供2017年生产的符合《浓缩苹果汁》等相关标准的12个批次浓缩苹果汁样品，由10名经过品评培训的专业人员组成评定小组对浓缩苹果汁样品的香气、滋味2个因素进行感官评定。采取10分制打分，对2个因素的得分分别按50%的权重计算出感官评定综合得分，感官评价评分表见表1。其中，感官评定综合得分大于等于8分的，认定为风味较好批次(A类)样品，得分小于8分的，认定为风味相对较差的(B类)样品。样品17-1～17-12感官评价综合得分分别为9.05±0.325、8.95±0.345、8.725±0.3、8.5±0.425、8.45±0.3、8.025±0.37、6.075±0.38、6.275±0.3、6.125±0.365、6.65±0.39、6.5±0.405、5.025±0.38，样品17-1～17-6得分大于8分，认定为A类样品，样品17-7～17-12得分低于8分，认定为B类样品。两类样品感官评价得分经显著性检验P<0.05，两组样品感官评价综合得分具有显著性差异。

表1 感官评价评分表

由厂家提供2018年生产的浓缩苹果汁样品(18-1～18-8)，用于该方法的验证。

1.3.2 样品的分析

(1)挥发性风味物质分析

取2 mL样品置于30 mL气相玻璃瓶，加入4 mL超纯水，2 g NaCl和1 μL 1.6 mg/mL 2-辛醇(内标)，加入磁力搅拌器，密封，40 ℃水浴平衡10 min，然后插入固相微萃取头，40 ℃水浴40 min，磁力搅拌速度为450 r/min。随后迅速将萃取头插入进样口解吸5 min，用GC-MS检测分析香气成分。

GC-MS条件：Agilent HP-5毛细管柱(30 m×250 mm×0.25 μm)。进样口温度250 ℃，氦载气流速1.0 mL/min，不分流。柱温程序：35 ℃保持1 min，以1 ℃/min升温至70 ℃保持2 min，然后以5 ℃/min升温至230 ℃维持2 min。质谱检测温度为220 ℃，EI电离能量为70 eV，捕获方式为全扫描，扫描范围为30～600m/z。

(2)氨基酸含量分析

取样品1 mL，12 000 r/min离心20 min，取上清液过膜。准确量取过膜后的样品10 μL于1 mL离心管中，加入已经配制好的衍生缓冲溶液200 μL，混匀后再加入衍生试剂溶液100 μL，混匀，将容量瓶置于60 ℃水浴中暗处恒温加热60 min，放置待溶液冷却至室温后，加入定容缓冲液700 μL稀释至刻度并摇匀，放置15 min后用0.22 μm滤膜过滤即可以开始进行HPLC检测分析氨基酸。

色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温：33 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：360 nm；流动相A为50%乙腈，流动相B为0.4%醋酸钠，称取4.1 g醋酸钠，加400 mL水，用HAC调pH至6.4，定容到1 L。

(3)有机酸和糖类化合物分析

将各浓缩苹果汁样品分别稀释10倍，然后各取2 mL稀释液，置于离心机，以12 000 r/min转速离心5 min后取上清液，滤液经0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC检测有机酸、糖类物质。

有机酸检测条件，色谱柱：Aminex HPX-87H lon Exclusion Column (7.8 mm×300 mm)；柱温：30 ℃；流速：0.6 mL/min；紫外检测器波长：215 nm；流动相：5 mmol/mLH2OS4；运行时间为21 min。

糖类化合物检测条件，色谱柱：Prevail Carbohydrate ES (250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温：40 ℃；流速：1.2 mL/min；检测器温度：45 ℃；流动相为V(乙腈)∶V(水)=78 ∶22。

1.4 主要差异风味化合物的筛选

首先分别对各样品挥发性风味物质、氨基酸、有机酸、糖类等风味物质进行主成分分析，确定该类化合物是否适用于样品的区分。若两类样品在该类风味物质组成上确实存在差异，再对该类风味物质中的所有化合物进行综合打分，打分结果大于0的物质即为该类风味物质中的主要差异风味化合物。

1.5 样品聚类分析与验证

对筛选得到的各类主要差异风味化合物进行组合，首先对各化合物浓度进行标准化处理以消除不同纲量带来的影响，并进一步进行聚类分析，筛选出的能够显著区分A、B两类样品的主要差异风味物质组合，即在该组合条件下A、B两类样品具有最低的类间相似性，且同类样品具有最高的类内相似性。

利用获得的最优组合，对待测浓缩苹果汁样品进行聚类分析，验证该方法的重复性。

1.6 数据处理方法

采用Excel和OrginPro 9.0软件对数据进行分析处理。采用SIMCA-P 11.5软件进行主成分分析(principal component analysis，PCA)。采用IBM SPSS Statistics 软件进行因子分析、综合打分，得到造成此差异的所有物质贡献率高低的排名，从而筛选得到对感官评价结果影响较大的风物物质。

采用Minitab 16.0软件进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 浓缩苹果汁理化指标分析

依据GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》[16]及GB/T 18963—2012《浓缩苹果汁》[4]中规定的相关浓缩苹果清汁理化指标检测方法对12个浓缩苹果汁样品进行可溶性固形物、总酸、pH、还原糖的测定。各批次浓缩苹果汁理化指标测定结果如表2所示，这12个浓缩苹果汁样品标均符合国标相关要求，可溶性固形物(20 ℃，以折光计)≥65.0 Bx，可滴定酸(以苹果酸计，可溶性固形物11.5%条件下测定)≥0.70。根据感官评价结果将12个样品分为两类，对品质较好的A类样品(17-1～17-6)和品质较差的B类样品(17-7～17-12)的理化指标进行差异显著性分析发现，A类样品和B类样品在可溶性固形物、总酸、pH和还原糖指标上并不存在显著差异(P值分别为0.628、0.248、0.127、0.751，P>0.05)，由此可知，样品的品质好坏与理化指标无关，主要是由风味物质组成及浓度差异导致。因此进一步对其主要风味化合物进行分析检测。

表2 浓缩苹果汁理化指标测定结果

2.2 浓缩苹果汁主要风味物质分析

2.2.1 挥发性风味物质分析检测

浓缩苹果汁样品中挥发性物质种类和含量情况结果如图1所示，12个样品共检测到39种挥发性风味物质，但样品间挥发性物质组成存在差异，其中样品17-1挥发性风味物质总相对含量最高，挥发性风味物质种类数也最多，样品17-11次之。

图1 浓缩苹果汁中挥发性风味物质种类和相对含量

在对浓缩苹果汁样品中挥发性风味物质初步分析的基础上，采用统计学软件(SIMCA-P 11.5)进行主成分分析，进一步分析两类样品挥发性风味物质的异同，结果如图2所示，其中主成分1、主成分2分别解释了总体信息的62.25%和16.71%，表明主成分分析结果比较可靠，能较好地解释样品的总体信息。

图2 浓缩苹果汁中挥发性物质主成分分析

由表3可以看出，所有的挥发性风味物质中综合打分排名靠前的化合物主要有糠醛、2,4-二叔丁基苯酚、邻苯二甲酸异丁基壬酯、1,2-苯二甲酸-2-甲基丙基酯、(E)-1-(2，6，6-三甲基-1，3-二环己烷-1-乙基)-2-丁烯-1-酮及邻苯二甲酸二丁酯(其中已查明糠醛具有特殊的杏仁香味，(E)-1-(2,6,6-三甲基-1,3-二环己烷-1-乙基)-2-丁烯-1-酮具有奶油香气)，说明这些化合物可能对浓缩苹果汁感官评定结果有重要影响。但是，由图2可以看出，样品17-1、17-3及17-11分散为3个孤点，说明利用挥发性风味物质难以很好地区分AB两类样品，主要由于同类样品间的挥发性风味物质存在较大差异，这与图1所得到的分类及含量结果保持一致，因此在后续主要差异风味化合物的筛选过程中不考虑挥发性风味物质。

表3 浓缩苹果汁挥发性物质主成分综合得分

2.2.2 氨基酸

采用柱前衍生法及紫外检测器-高效液相色谱仪对浓缩苹果汁样品中的氨基酸成分进行测定，结果如图3所示，在氨基酸组成上，两类浓缩苹果汁中氨基酸种类组成情况基本相似，但浓度各不相同，对A、B两类样品氨基酸总浓度进行T检验，得出t值的绝对值为2.765，表明两组数据存在差异性显著(P<0.05)。有趣的是，A类浓缩苹果汁中氨基酸总浓度平均水平(11.8 g/L)低于B类(13.7 g/L)。氨基酸是食品中常见的风味物质，对食品的香气和滋味具有重要影响。不同的氨基酸呈现不同的风味，从而对食品的整体风味产生影响。如图3所示，浓缩苹果汁样品中含量较高的氨基酸依次是蛋氨酸(31.9%～47.8%)、丝氨酸(25.4%～39.5%)和天冬氨酸(10.3%～16.4%)，这些氨基酸对浓缩苹果汁的风味有较大影响。其中，蛋氨酸具有腥臭气味，丝氨酸呈甜味，天冬氨酸呈鲜味，这些氨基酸可能对苹果特有的香气和滋味产生负面作用，因此氨基酸浓度较低的样品反而感官品评的得分较高。

图3 浓缩苹果汁氨基酸分类含量

为了更为直观地得到12个批次浓缩苹果汁样品氨基酸组成的差异性情况，进行主成分分析，结果如图4所示。其中主成分1、2分别解释了总体信息的47.51%和28.62%，表明主成分分析结果比较可靠。由图4可知，两类样品被很好地分到2个区域，这说明可以通过氨基酸组成的差异来区分两类浓缩苹果汁样品品质。

图4 浓缩苹果汁中氨基酸主成分分析

利用IBM SPSS Statistics 19软件对氨基酸测定结果进行因子分析及综合打分处理，结果见表4，在14种氨基酸成分中有3种物质得分大于0，即它们的贡献率大于平均水平，分别为蛋氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，因此暂定这3种氨基酸为差异风味化合物，用于后续聚类分析。

表4 浓缩苹果汁氨基酸主成分综合得分

2.2.3 有机酸

利用紫外检测器-高效液相色谱仪对浓缩苹果汁样品中的有机酸成分进行测定[18]，共检测到6种有机酸，其中乳酸含量及未检测到的富马酸均符合国标要求。各浓缩苹果汁样品中有机酸具体组成情况如图5所示，含量较高的有机酸依次是苹果酸(62.7%～72.3%)、乳酸(19.8%～30.9%)、柠檬酸(4.6%～7.5%)。同时，前6个感官评定较好批次浓缩苹果汁除苹果酸、乳酸平均含量稍低于较差批次果汁外，其余4类有机酸平均含量均高于较差批次。

图5 浓缩苹果汁中有机酸分类含量

在有机酸含量测定结果基础上，进行主成分分析，其结果如图6所示。其中主成分1、主成分2分别解释了12个浓缩苹果汁样品中6种有机酸含量总体信息的58.99%和25.11%，表明主成分分析结果比较可靠，能较好解释样品的总体信息。可观察到除去1、9两点，其余样品浓缩苹果汁被较好的分到2个区域，可见浓缩苹果汁样品因其有机酸组成上的差异。

图6 浓缩苹果汁中有机酸主成分分析

利用IBM SPSS Statistics 19软件对除去17-1及17-9样品其余10个批次浓缩苹果汁的有机酸含量测定结果进行因子分析及综合打分处理。由表5综合得分结果可知，在6种有机酸成分中有2种物质得分大于0值，即它们的贡献率大于平均水平，进而得出这6种有机酸成分中对苹果汁品质影响较大的2种物质，分别为苹果酸和乳酸，选取这2个物质用于后续聚类分析。

表5 浓缩苹果汁有机酸主成分综合得分

2.2.4 糖类物质

利用示差折光检测器-高效液相色谱仪对浓缩苹果汁样品中的糖类物质成分进行测定，共检测到4种糖类物质，如图7所示，含量较高的糖类物质为果糖(52.3%～56.6%)，其次是葡萄糖(21.1%～28.5%)。

图7 浓缩苹果汁糖类物质分类含量

在糖类物质含量测定结果基础上，进行主成分分析，其结果如图8所示。其中主成分1、主成分2分别解释了12个浓缩苹果汁样品中4种糖类含量总体信息的43.18%和32.07%，表明主成分分析结果比较可靠，能较好地解释样品的总体信息。可观察到12个样品点分布相对较分散，说明各样品的糖类物质组成存在较大波动性，但2个区域区分较明显，由此说明果汁样品在糖类物质组成上存在的差异性可使其较好地分为两类。

图8 浓缩苹果汁中糖类物质主成分分析

利用IBM SPSS Statistics 19软件对糖类物质测定结果进行因子分析及综合打分处理，由表6可知，在4种糖成分中有2种物质得分大于0值，分别为果糖和葡萄糖，选取这2个物质用于后续聚类分析。

表6 浓缩苹果汁糖类物质主成分综合得分

2.3 主要风味物质的聚类分析

2.3.1 聚类分析模型优化

由浓缩苹果汁的风味物质测定及主成分分析结果可知，挥发性物质的PCA得到的2个样品聚集区域区分不是十分明显，而根据氨基酸、有机酸和糖类的均可以将浓缩苹果汁分到2个区域，因此选取这3类不挥发性物质(共7种)进一步做聚类分析，优化聚类分析模型。

由于各个指标的单位不同、量纲不同、数量级不同，不便于分析，甚至会影响评价的结果。所以，首先对数据进行标准化处理，消除不同纲量带来的影响，而后进行聚类分析。聚类分析结果如图9，样品17-1～17-6聚集为一类，类内样品间相似性在53.12%～56.59%；17-7～17-12聚集为一类，其类内样品间相似性在64.02%～68.06%。

由以上7种物质进行聚类分析得到的聚类结果并不理想，故将这7种物质进行排列组合再次聚类，力求得到最高的相似性值，为了保证结果的可靠性和全面性，组合物质个数至少选择5个，共得到29种物质组合方法，其聚类分析结果如表7。

图9 浓缩苹果汁的主要风味物质聚类分析

表7 不同风味物质组合聚类分析结果

注：“*”表示有一个样品未正确聚类，“—”表示未能良好聚为两类，故没有相似性值。

通过分析可得到第24号组合即天冬氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、果糖、葡萄糖进行聚类时得到聚类分析结果相对最好，其结果如图10所示。将风味评定较好的批次浓缩苹果汁分到一类，各果汁相似性聚集在54.95%～65.11%，风味较差批次浓缩苹果汁分到一类，各果汁相似性聚集在72.43%～84.26%。

图10 浓缩苹果汁的主要风味物质聚类分析

2.3.2 聚类分析方法的验证

为了对以上所建立的苹果醋原料风味品质判别方法进行验证，随机选取苹果汁厂于2018年生产的8批次样品，分别对以上样品进行风味物质测定，然后进行聚类分析，其聚类结果如图11所示，其中，观测值1～5为浓缩苹果汁样品18-1～18-5，它们为感官评定为风味较好的批次，6～8为浓缩苹果汁样品18-6～18-8为风味较差批次。

图11 浓缩苹果汁的主要风味物质聚类分析

由图11可看出用于验证的8个浓缩苹果汁样品中样品18-1～18-5类内相似性高于68.03%聚为一类，样品18-6～18-8类内相似性高于78.65%聚为一类，说明风味较好与较差批次苹果汁被明显区分，由此也就验证了利用所筛选的5个主要风味物质(蛋氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、果糖及葡萄糖)建立的聚类分析能用于浓缩苹果汁样品风味品质优劣的快速判断。

3 结论

本文将人工感官评价手段与聚类判别方法相结合[21]，通过对感官评定较好和较差的2组浓缩苹果汁的主要风味化合物进行分析检测，利用主成分综合打分的方法筛选出各指标中对风味贡献率较大的化合物。通过聚类分析选出5个主要风味物质，分别为蛋氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、果糖及葡萄糖，以此建立聚类分析模型，并应用用于浓缩苹果汁样品感官评定分析，增加了浓缩苹果汁风味品质的判定的客观性和准确性，极大地提高了苹果汁风味判别结果的可靠性，同时也为生产者合理调整工艺提供一定的理论参考。