贝壳源纳米乳酸钙的制备与表征

徐霞，杨邦伟，蔡燕萍，刘书来，刘建华，丁玉庭*

1(浙江工业大学 海洋学院，浙江 杭州，310014)2(国家远洋水产品加工技术研发分中心(杭州)，浙江 杭州，310014)

贝壳是一种良好的天然钙源，其CaCO3含量高达95%以上[1]。我国沿海贝壳资源丰富，但大量贝壳废弃物多被堆积遗弃，易造成环境污染和资源浪费。国内外研究发现废弃贝壳可用于各种补钙制剂的制备与生产[1-2]，但综合利用率仍相对较低。钙是人体内必需元素之一，也是组成人体骨骼、牙齿、脏器、血液和肌肉组织的重要成分，人体缺钙时可发生各种生理功能障碍。市场上补钙制剂品种繁多，乳酸钙因其钙含量高、溶解度较大、吸收率高、安全性高、价格合理等优点而备受关注。但普通钙剂被人体吸收利用率较低，局限性明显[3]。CHO等研究发现，纳米级颗粒有较高的吸收率且有效成分分布更广泛，有望克服普通钙剂现有的局限。原因是钙的吸收利用率常常受到吸收部位药物溶出速度的支配，纳米粒径的钙可以无需消化吸收而直接穿透组织间隙，提高人体对钙的吸收速度且增加分布广度，从而提高生物利用度[4-5]。基于此，探索以贝壳为钙源的纳米乳酸钙的绿色高效制备方法，对提高钙的吸收效率及贝壳综合利用率具有重要意义。

利用贝壳制备乳酸钙以煅烧法[6-7]和发酵法[8]居多，煅烧法制备乳酸钙需要消耗大量能源煅烧贝壳去除有机杂质，产生大量废气对环境不友好；发酵法需要使用乳酸菌发酵产生乳酸再与贝壳反应，生成乳酸钙，此法产生大量富营养废水，产生的乳酸酸性较弱反应时间长。制备纳米乳酸钙的方法有化学沉淀法和层状液晶法[9]等，化学沉淀法在缓慢冷却饱和乳酸钙热溶液的过程中，对pH值控制的要求严苛、重现性差，难以规模化。层状液晶法制备纳米乳酸钙需使用大量有机试剂形成液相界面，在生产过程中存在安全隐患，易残留有毒有害成分在成品中且工艺过程复杂、对设备要求较高且污染环境[5,9-11]。

表面活性剂可促进晶体成核，减缓晶核的形成速率或抑制晶体快速长大，已被广泛报道应用于有机和无机纳米粉体材料的生产[11]，在食品领域以乳化剂、增稠剂等应用为主，此方面的研究和报道较少。本文提出一种乳酸钙晶体纳米化的新工艺方法，在中和反应后的重结晶阶段添加微量的表面活性剂结合高速剪切来控制晶体粒径并保持分散性，无需高温煅烧，亦无需使用有毒有害试剂，是一种环境友好的制备新工艺。此外相较于现有制备方法，本工艺对仪器设备的要求低、制备工序少、成本低且环保绿色，为贝壳的综合利用提供了一种新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 原料与试剂

贻贝贝壳,取自嵊泗县贻贝壳集中处理中心。乙醇(95%)、无水乙醇、乳酸、吐温80(聚山梨酯80)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)标准溶液、钙红指示剂，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 仪器

超低温冰箱U410-86，英国New Brunswick Scientific；冷冻干燥机SCIENTZ-12N，宁波新芝生物科技股份有限公司；高速离心分散机T25D，德国IKA；透射电子显微镜Tecnai G2 F30，FEI美国；X射线衍射仪X′Pert Pro，荷兰帕纳科；傅立叶变换显微红外光谱仪Nicolet 6700，美国Thermo。

1.2 实验方法

1.2.1 贻贝壳预处理

取废弃贻贝壳置于清水中，粗略去除大量附着的海藻及残留的贻贝肉。洗净后用0.1%HCl溶液浸泡1 h，彻底去除表面附着的外套膜及贝肉，洗净后烘干备用。将贻贝壳砸碎后用万能粉碎机粉碎。过40目筛，储存备用。

1.2.2 纳米乳酸钙制备的工艺流程

制备纳米乳酸钙的工艺流程主要由中和反应、纳米化重结晶和纯化干燥3个过程组成。在加热超声环境中贝壳粉与食品级乳酸溶液发生中和反应。反应后静置降温，调节pH值，放入恒温箱中缓慢匀速降温至22 ℃。取出乳酸钙过饱和溶液，在晶体析出重结晶前快速向溶液加入适量吐温80，同时以适当的转速高速剪切一段时间，控制析出的乳酸钙颗粒粒径及其粒度分布。将乳酸钙悬浊液低速离心，弃去上层清液，用适量无水乙醇反复冲洗纳米乳酸钙，去除表面活性剂、提高乳酸钙纯度。最后，冻干乳酸钙，制得食品级纳米乳酸钙粉体。其中乳酸钙在水中的溶解度随着温度变化而变化，55 ℃为其溶解度曲线的拐点温度[13]，在降温结晶时效率最高，故设反应温度为55 ℃。

工艺流程如下：

预处理贝壳粉→加入乳酸→置于加热超声环境→中和反应→取出静置降温→调节pH值→缓慢降温重结晶→加入表面活性剂→高速剪切→低速离心→无水乙醇醇洗→冷冻干燥→纳米乳酸钙粉体。

1.2.3 中和反应工艺优化

通过单因素试验优化并确定经过中和反应过程中乳酸的用量以及反应时间。乳酸用量单因素试验：取2.0 g贻贝壳粉，加入40 mL蒸馏水中，缓慢搅拌防止贝壳颗粒沉底，将反应容器置于55℃的水浴中，缓慢加入6 mol/L乳酸溶液 (0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mL)。120 min反应后，经过抽滤、降温、过滤即得乳酸钙粗产品，干燥后分别称量比较产率，由于本试验原料取用量一致，结果用乳酸钙的产量作对比；中和反应时间单因素试验：取贻贝壳粉2.0 g，加入40 mL水，加入1.8 mL乳酸溶液(6 mol/L)，55 ℃水浴反应不同时间(30、60、90、120和150 min)后，计算并比较乳酸钙的产率，计算方法如公式(1)：

(1)

式中：实际产量，反应后乳酸钙烘干后称重的质量，g；理论产量，使用贝壳的重量计算其CaCO3含量，进一步计算中和反应生成乳酸钙的理论质量，g。

1.2.4 乳酸钙的粒径控制及工艺优化

称取10 g制备的乳酸钙粗产品，溶解于100 mL 55℃的蒸馏水中。饱和后，将其放置在室温下冷却到30℃，然后置于22℃恒温箱中，令其缓慢降温至22℃，调节pH值至7.0左右。随后通过单因素试验和响应面试验优化纳米乳酸钙的粒径控制工艺，筛选较优的表面活性剂并确定添加量、剪切速度及剪切时间。

(1)单因素试验方法

表面活性剂筛选及添加量确定：取配置好的1 L乳酸钙溶液降温并调节pH后分别加入0、5、10、15、20、40、60和80 μL的吐温80、吐温40或吐温20，并用高速剪切机以7 000 r/min的速度搅拌210 s，随即转移至离心管中固液分离和纯化；剪切速度：加入20 μL的吐温80，并用高速剪切机分别以0、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000 r/min的速度搅拌210 s，随即转移至离心管中固液分离和纯化；剪切时间：加入20 μL的吐温80，并以7 000 r/min的速度搅拌0、30、60、90、120、150、180、210 s，随即转移至离心管中固液分离和纯化，分别测定并比较其粒径。

(2)响应面试验设计

在单因素试验基础上，以剪切速度和剪切时长为响应因素，乳酸钙粒径为响应值，利用Design-Expert10.0软件进行响应面试验设计和数据分析。

1.2.5 纯化与干燥参数优化

采用无水乙醇多次清洗去除所制备的乳酸钙中残留的表面活性剂。通过单因素试验优化纯化及干燥工艺，并确定洗涤次数、无水乙醇的添加量以及干燥时间参数。

洗涤次数单因素试验：加入乳酸钙10倍体积的无水乙醇，分别洗涤1、2、3、4、5、6次后，弃去上层清液并将纯化的乳酸钙移至培养皿中，适当处理后置于冻干机中，冻干6 h；无水乙醇添加量单因素试验：分别加入乳酸钙0、2、4、6、8、10倍体积的无水乙醇，缓慢搅拌后静置弃去上层清液，重复2次后将乳酸钙移至培养皿中，-80℃预冷8 h，转移至冷冻干燥机中干燥6 h；干燥时间单因素试验：加入乳酸钙10倍体积的无水乙醇，缓慢搅拌后静置弃去上层清液，分别重复两次。将纯化的乳酸钙移至培养皿中，适当处理后置于冻干机中，分别冻干0、1、2、3、4、5、6 h，并测定乳酸钙产品的纯度。

1.2.6 测定与表征方法

根据国标GB 1886.21—2016《食品安全国家标准 食品添加剂 乳酸钙》[14]，利用EDTA络合滴定法测定纳米乳酸钙产品中的钙含量并以此可计算产品的纯度及乳酸钙产量。根据国标GB 1886.21—2016，利用干燥减重的测定方法确定含水量。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)被用于乳酸钙中氟化物及重金属元素含量的测定：将样品消化后，过滤，蠕动泵送入雾化器，利用同心型气动雾化器产生气溶胶，在载气载带下喷入焰炬，进样量大约为1 mL/min。

透射电子显微镜(TEM)表征：取0.1 g纳米乳酸钙，加入10 mL无水乙醇超声10 min，滴于铜网上并低温阴干，放入Tecnai G2 F30中用于TEM观察、拍照，统计颗粒的粒径；傅里叶透射红外光谱(FT- IR)表征：取0.1 g样品加入到0.15 g KBr粉末中，置于红外灯照射环境下用玛瑙研钵研磨2～3 min，充分混合后压片，利用傅立叶变换显微红外光谱仪Nicolet 6700全波段扫描，绘制红外光谱图；X-射线衍射(XRD)表征：取纳米乳酸钙粉末样品研磨后，置于玻璃样品盒中，按压结实后放入X射线衍射仪X'Pert Pro中测定所制备乳酸钙的晶体结构。

2 结果与分析

2.1 中和反应工艺条件的优化

由图1-A可知，中和反应当乳酸用量增加至1.8 mL时乳酸钙产量达到最高值2.1 g，产率为95.0%，贝壳粉中所有的CaCO3都反应成为乳酸钙，杂质为贝壳中的有机物。由于此单因素试验贝壳粉使用量固定在2.0 g，即乳酸最优使用量为每克贝壳粉，使用0.9 mL乳酸。由图1-B可知，乳酸与贝壳粉经120 min反应完全，由于乳酸酸性较弱，反应推进速度慢，所以反应时间较长。

故中和反应的最佳制备工艺参数为：每克贝壳粉使用0.9 mL乳酸；反应时间为120 min时，中和反应较为充分、高效，在工业生产时及时用量增大，最制备工艺参数同样可行。

A-中和反应乳酸用量；B-中和反应时间

2.2 表面活性剂种类及浓度对乳酸钙粒径的影响

微量的表面活性剂在盐饱和液中具有降低表面张力、增大表面活性并增大盐类结晶过程中的界面能[15]，也就是表面活性剂的存在一方面可以促进成核，另一方面可以减缓晶核形成速率或抑制晶体快速长大，从而可以减小晶体粒径，并改善晶体的粒度分布[16]。

因此，在本研究中通过添加微量的表面活性剂来控制乳酸钙颗粒的粒径，并防止其在干燥过程中再次团聚。其中，表面活性剂的种类和添加量至关重要。为了较好地控制乳酸钙颗粒的粒径，选择表面活性剂的方法遵循：亲油基链长，易于形成胶团的高分子材料[17]。此外，由于目标产物为食品级，所选表面活性剂还需要满足符合国家标准的食品级添加剂，且在完成制备工序后易洗涤去除。基于此，本实验选用吐温80、40和20这3种表面活性剂来研究其对乳酸钙粒径的影响。

如图2所示为不同表面活性剂和添加量对乳酸钙粒径的影响。根据试验结果，表面活性剂在最终反应液中的浓度为0～20 μL/L，随着添加量的增加，粒径呈线性减小；当表面活性剂的最终浓度超过20 μL/L时，乳酸钙的粒径不再随着表面活性剂的增加而变化。吐温80在乳酸钙粒径控制方面效果较优，最佳添加量为反应液中浓度20 μL/L。纳米粉体的合成中，表面活性剂的添加量可根据临界胶束浓度理论(critical micelle concentration theory)[18-20]计算：表面活性剂在达到一定浓度前，其添加量与分散效果呈线性正比；达到一定浓度后其分散效果将达到一个稳定状态，其添加量增加也不会让分散效果进一步提高；其添加量过多容易造成表面活性剂之间的基团相互纠缠导致粒径的小幅上升[21]。试验中用到的表面活性剂的临界胶束浓度值均为20 μL/L左右[22]，与我们的试验结果一致；吐温80的亲油基链较长，亲油性强，在水溶液中易形成胶团，包裹乳酸钙颗粒，可有效抑制晶体的生长，且毒性最低、安全性最高，故首选食品级吐温80。

图2 表面活性剂种类及浓度对乳酸钙颗粒平均粒径的影响试验结果图

2.3 乳酸钙粒径控制工艺参数的优化

根据DLVO理论(DLVO theory)，表面活性剂影响纳米颗粒的分散机理是降低微粒表面张力与增加水的亲和性和颗粒之间的吸引能，并形成排斥能。吸引能和排斥能之和等于总位能，总位能决定微粒间的距离。这2种相反的作用力平衡在70 nm[22]。由此，本文所述利用表面活性剂控制粒径的理论极限粒径为70 nm。乳酸钙颗粒的析出过程为瞬间形成晶核，过饱和溶液中的离子在晶核基础上快速附着成为乳酸钙晶体，并不断生长[15]。而表面活性剂包裹已经存在的晶体后，阻隔了晶体与过饱和溶液中离子的界面能，阻断了晶体的继续生长。高速剪切使表面活性剂快速均匀分布在溶液中，尽快地包裹晶体并阻止其进一步生长。因此，在乳酸钙重结晶阶段，晶体析出前添加表面活性剂并结合高速剪切，能阻止乳酸钙晶体长大，控制粒径在100 nm以下，理论上是可行的。

鉴于剪切速度和剪切时间的工艺参数，直接决定了生产中所需使用的仪器设备规格及功率，而单因素试验的结果较为粗略。为了获得较为准确的工艺参数，以剪切速度和剪切时间为响应因素，设计试验且对所得数据进行分析，对影响还原力的各因素进行拟合，得到回归方程：

Y=172.30-120.88×A-27.33×B+8.00×AB+35.65×A2+6.10×B2

根据图4响应面试验结果所示，当剪切速度为9 000 r/min，剪切时间240 s，吐温含量为20 μL/L时，平均粒径达到了最小值73.1 nm。剪切速度对粒径的影响较大，且决定了生产时所需仪器的性能与功率，在剪切速度7 500 r/min，剪切时间240 s时，乳酸钙粒径已经达到了设计要求。考虑到生产设备与成本的制约，尽量选择剪切速度最小的工艺参数，建议采用的工艺参数组合为：剪切速度7 500 r/min，剪切时间240 s，吐温80添加量为最终反应液中浓度为20 μL/L。验证试验制得乳酸钙平均粒径为95.1 nm。

A-响应面试验俯视等高线图;B-响应面试验3D结果图

此外，乳酸钙的纳米化重结晶，首次可析出乳酸钙约为热溶液中乳酸钙总质量的9.5%；再次加热溶解乳酸钙和表面活性剂进行循环生产，析出量约为再次溶解乳酸钙量的99%。循环生产多次后，平均产率可达90%，且随着循环次数的增加而增加。循环补料生产的方法，还有待进一步改进。

2.4 纯化与干燥工艺参数的优化

乳酸钙不溶于乙醇，吐温80溶解于乙醇中，为了提高纯度，减少乳酸钙损耗，选择使用无水乙醇冲洗。为减少干燥过程中温度对纳米颗粒粒径的影响，选择冷冻干燥为纳米乳酸钙颗粒的干燥方式。中和反应及重结晶过程均是在室温下进行，因考虑到纳米乳酸钙的制备方法最终是要应用到实际生产，而工厂化生产中进行大规模的降温不是绿色、高效、经济的选择，故在实验过程中也应贴近实际，选择室温(25℃左右)为试验环境温度。

由图4-A，洗涤次数单因素试验结果可知，用无水乙醇洗涤纳米乳酸钙达3次时，纯度达到了最高值为99.5%，由于无水乙醇中含有少量水，造成了极少的损耗。由图4-B无水乙醇添加量单因素试验结果可知，随着洗涤剂使用量的不断增加，纳米乳酸钙的纯度在随之不断的升高。当无水乙醇的使用量达到纳米乳酸钙体积的5倍时。洗涤效果达到了最佳值，此时纳米乳酸钙纯度为99.5%。由图4-C干燥时长单因素试验结果可知，冷冻干燥3 h后，纳米乳酸钙已经完全干燥。故洗涤纯化经过纯化与干燥过程的最佳工艺参数为5倍体积的无水乙醇洗涤3次后冻干3 h，此时制得的纳米乳酸钙粉体经纯度测定，纯度为99.5%。

2.5 纳米乳酸钙产品表征与分析

2.5.1 FT-IR结果分析

2.5.2 XRD结果分析

通过XRD检测方法，根据图6对比乳酸钙的XRD标准数据来源于ICDD数据库，4个关键特征峰的2θ值均出在现在样品的XRD图谱中[23]，且衍射峰尖锐清晰，说明该样品为L-乳酸钙且纯度高。观察其性状为白色且无味，与L-乳酸钙应有的表观性状一致。

A-无水乙醇洗涤次数；B-无水乙醇添加量；C-冷冻干燥时间

A-乳酸钙标准红外图谱；B-纳米乳酸钙样品的红外结果图

A-纳米乳酸钙XRD结果图;B-乳酸钙产品图

2.5.3 TEM分析

为确定所制备的乳酸钙样品颗粒的尺寸及形貌，用TEM观测形貌并测量粒径。如图7-ATEM测定结果所示，制备的纳米乳酸钙大小分布均匀，形态为圆球形。粒度统计分布如图7-B，纳米乳酸钙固体平均粒径为95.1 nm，统计颗粒数超过500个。

A-纳米乳酸钙TEM照片;B-乳酸钙粒度分布统计结果

2.5.4 其他污染物监测结果

ICP-MS检测结果如表1所示，所有指标均符合GB1886.21—2016《食品添加剂乳酸钙的食品安全国家标准》[13]的要求，说明利用吐温80这种表面活性剂控制乳酸钙粒径、制备的纳米乳酸钙可安全食用。

表1 其他污染物含量表

3 结论

综合以上分析结果，以废弃贝壳为钙源，通过中和反应、纳米化重结晶、纯化干燥等过程制备纳米乳酸钙的较优工艺条件为：每克贝壳粉添加0.9 mL乳酸溶液、中和反应时间120 min；剪切速度7 500 r/min、剪切时间240 s、表面活性剂吐温80最终反应液中的浓度为20 μL/L；5倍体积的无水乙醇洗涤3次、冻干3 h。所制备的纳米乳酸钙平均粒径为95.1 nm，纯度达99.5%，且符合食品级添加剂的国标质量要求。

本文研究了一种贝壳的高值化利用新方法及其较优工艺条件，使用表面活性剂与高速剪切相结合的新方法控制乳酸钙晶体的粒径并防止其团聚。此方法与工艺适合工厂化生产纳米级乳酸钙，在整个生产过程中没有苛刻的条件，制备工序少、成本低，且使用的试剂均为食品级，无有毒有害试剂，所制备的纳米乳酸钙符合食品级添加剂的国标。