环境因子对鱼类性别决定及分化的影响研究进展

沈旭芳 王连顺 闫红伟

摘 要：鱼类是脊椎动物中的一个最大类群，阐明鱼类性别决定和分化机制可以帮助我们理解整个脊椎动物类群的性别决定及分化机制乃至进化途径。更为重要的是，在生产上，以鱼类性别决定及分化的调控机制為理论基础，对其进行性别控制、实现单性养殖具有重要的经济意义。该文对近年来关于环境因子对鱼类性别决定及分化的影响研究进展进行了综述，以期为该领域的深入研究和生产上开发人工诱导性逆转技术提供理论参考。

关键词：环境因子;鱼类;性别决定与分化;研究进展

中图分类号 S917.4文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）01-0071-06

Abstract：Fish are one of the largest groups of vertebrates，and elucidating the mechanism of fish can help us to understand the mechanism of sex determination and differentiation，and the evolutionary process of the whole group of vertebrates.More importantly，it is of great economic significance to produce monosex fish based on the regulatory mechanism of fish sex determination and differentiation in aquaculture.This review will provide a reference for the further study in this field and the development of a new efficient，simple and environmentally-friendly

Key words：Environmental factors;Fish;Sex determination and differentiation;Research progress

性别决定是指决定未分化的性腺向精巢方向发育，还是向卵巢方向发育的过程[1]。性别分化则是指具有双向分化潜能的生殖嵴，经过一系列的分化发育形成精巢或卵巢，其生殖细胞最终发育成精子或卵子，并出现第二性征的过程[2]。长期以来，揭示脊椎动物的性别决定及分化的背后机制，一直都是发育生物学、进化生物学、遗传学、生理学等众多学科关注的研究热点[3]。鱼类处于无脊椎动物向脊椎动物进化过程中的初始阶段[1]，在动物系统进化中处于承前启后的地位。而且鱼类是脊椎动物中最大的一个类群，物种数量在已知的脊椎动物中占50%以上，几乎涵盖了脊椎动物所有的染色体类型（如XX/XY;ZW/ZZ;ZO/ZZ;XX/XO;WXY;X1X1X2X2/X1X2Y）。为了适应所栖居水环境的变化，鱼类呈现出了丰富特殊的生殖对策。阐明鱼类性别决定和分化机制，可以帮助我们理解整个脊椎动物类群的性别决定和分化机制乃至进化途径。更为重要的是，很多经济鱼类雌鱼和雄鱼个体大小异型[3]，如半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）雌鱼的生长速度是雄鱼的2～4倍，而尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）其雄鱼比雌鱼生长快30个百分点。而有些鱼类，如红鳍东方鲀（Takifugu rubripes），虽然雌雄个体在生长上无显著差异，但是雄鱼的精巢无毒、而卵巢有剧毒，因而雄鱼的经济价值更高。在生产上，以鱼类性别决定及分化的调控机制为理论基础，对其进行性别控制、实现单性养殖具有重要的经济意义[4]。

与高等脊椎动物不同，鱼类的性别分化过程具有极高的可塑性，大量研究发现，环境因子（如激素、温度、光照和低氧等）在鱼类性别分化途径中起着重要的作用，环境因子的变化会使鱼类出现性逆转的现象。随着分子生物学研究手段的开发与应用以及高通量测序技术的快速发展，研究者已逐步从分子水平揭示了外界环境因子对鱼类性别决定及分化的影响机制。本文对近年来该方面的研究进行了综述，以期为该领域的深入研究，并为生产上开发高效、简单和环保的人工性逆转诱导方式提供理论参考。

1 鱼类性别决定及分化的分子调控网络

脊椎动物的性别决定被分为遗传型性别决定（genetic sex determination，GSD）和环境型性别决定（environmental sex determination，ESD）[5]。多数哺乳类的性别主要由染色体上的遗传基因决定，即遗传决定型（GSD），由位于性染色体上的决定基因（Sry，sex-determining region on the Y chromosome;Dmrt1，Doublesex and mab-3 related transcription factor 1 等）启动一系列性别相关基因参与的级联信号通路，从而诱导未分化生殖腺发育成卵巢或精巢[6-7]。但在鸟类、爬行类、两栖类和鱼类中并未发现Sry的同源基因，表明Sry是哺乳类特有的性别决定基因。在鱼类中，Dmy（Y-linked DM domain gene）是首个发现的性别决定基因，但是鳉科鱼类中，仅有日本青鳉（Oryzias latipes）和弓背青鳉（O.curvinotus）存在Dmy基因。因此，从进化角度来看，青鳉的Dmy起源于青鳉与其它鳉科鱼类分开之后，是演化上出现较晚的一个基因，它不是一个在鱼类中广泛存在的性别决定基因[8]。随着有关鱼类性别决定机制的深入研究，人们陆续从银汉鱼（Odontesthes hatchery）、吕宋青鳉（O.luzonensis）、红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）和恒河青鳉（O.dancena）等中分别筛选和鉴定了性别决定基因或位点Amhy（Y-linked anti-Müllerian hormone）[9]，Gsdfy（gonadal soma derived growth factor on the Y chromosome）[10]，Amhr2（anti-mullerian hormone receptor type Ⅱ）[11]，Irf9（interferon regulatory factor）[12]，Dmrt1 [13]，Sox3（SRY-box containing gene 3）[14]。综上，鱼类的性别决定的“起始开关”具有多样性。与之相反，虽然Herpin等[15]研究指出哺乳类和青鳉的下游性别分化的调控网络存在差异，但是参与性别分化的相关基因在脊椎动物中具有相对保守性，如Sox9（SRY-box containing gene 9）、Gsdf、Dmrt1和Amh（anti-mullerian hormone）等参与鱼类精巢分化过程，雌二醇合成相关的芳香化酶编码基因Cyp19a1a（cytochrome P450，family 19，subfamily A，polypeptide 1a）、foxl 2（forkhead transcription factors2）和sf1（steroidogenic factor 1）几乎参与所有的卵巢分化过程[16]。

因此，迄今为止，人们认为具有双向分化潜能的鱼类未分化的性腺，在被称为“性别决定总开关”的性别决定基因开启后，一类保守的性别决定和分化的分子调控网络随后被激活。這类下游性别相关基因能调控性类固醇激素的表达，从而控制着性腺发育最终分化为一个有功能的性腺并与性别表型相对应[17-19]。也有观点认为，鱼类性别决定不是一个单一的遗传级联反应，也不是遗传网络分级呈现的结果，而是不同遗传模块（genetic modules）相互交联并以模块化的形式发挥功能[6]。

2 环境对鱼类性别决定及分化的影响及其机制

2.1 激素对鱼类性别决定及分化的影响 1969年，Yamamoto开创性的利用外源雄激素和雌激素分别诱导青鳉（O.latipes）产生100%的雄性化和雌性化，从而提出雌激素和雄激素分别是内源性的雌性和雄性诱导剂的假说[20]。此后，在近40年的时间里，许多研究探讨了激素对鱼类性别分化过程的影响[21-22]。研究中常用的外源性雄激素有17α-甲基睾酮（17α-methyltestosterone，MT）、17α-乙炔基睾酮（17α-ethinyl testosterone）和雄烯二酮（androstenedione）。给30日龄的牙鲆（Paralichthys olivaceus）投喂拌有10μg/g17α-甲基睾酮的饲料70d，雌鱼成功发生性别逆转，其性腺组织中的Cyp19a1a基因表达被抑制，而Dmrt1基因表达上调[23]。常用外源性雌激素有雌酮（estrone）、17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）和17α-乙炔基雌二醇（17α-ethinyl estradiol）。雄性鲤鱼（Cyprinus carpio）暴露于含有雌酮的水体90d，其性腺会出现输卵管和卵母细胞[24]。处于性别分化关键时期的雄性尼罗罗非鱼经17α-乙炔基雌二醇诱导会完全性逆转，其性别相关基因Cyp19a1a表达上调，Dmrt1表达下调[25]。在对红鳍东方鲀研究中发现，雌二醇对性别分化的影响具有剂量依赖性。将孵化后15d的河鲀幼鱼浸泡在含有10μg/L和100μg/L雌二醇水体中85d后，10μg/L雌二醇浸泡处理的所有个体发育成雌鱼，但是转移到正常水体中饲养到孵化后160d发现，性腺发育成间性性腺。饲养到孵化后270d，性逆转的性腺恢复到精巢。而100μg/L雌二醇浸泡处理所有个体也发育成雌鱼，转移到正常水体中饲养到孵化后160d，性逆转雄鱼中38%的个体性腺依旧是卵巢、62%已经发育成间性性腺。在270dph达到43%和57%，400dph时为56%和44%，没有完全重新恢复到精巢的个体。研究人员近一步研究发现，性逆转个体性腺中的Cyp19a1a、foxl2和sox9b基因的表达水平上升，Dmrt1、Amh和sox9a基因的表达水平降低[26]。

Cyp19a1a是细胞色素P450家族的一种催化雄激素合成雌激素的复合酶。Cyp19a1a的活性直接与体内雌激素的生成量有关，而芳香化酶抑制剂能在不影响其它激素生物合成的情况下，抑制芳香化酶的活性，使雄激素无法转化为雌激素，专一性地降低雌激素水平。芳香化酶抑制剂有氨鲁米特（aminoglutethimide，AG），睾内酯（testolactone），甾体福美司坦（formestane），法曲唑（fatrolzole）非甾体类阿那曲唑（anastrolzole），来曲唑（letrolzole）和甾体类依西美坦（exemestane）。其中，来曲唑是第3代芳香化酶抑制剂，具有高度特异性的特点，抑制芳香化酶作用达到的98%～99%。对血清中肾上腺皮质醇、醛固酮水平和甲状腺功能也无负面影响，是目前选择性最强的芳香化酶抑制剂[27]。研究表明，用100μg/g和200μg/g剂量的来曲唑可促进胡子鲇（Clarias fuscus）精巢分化、抑制卵巢分化，卵巢腔最早出现时间和初级卵母细胞出现时间均分别推迟3d和6d，而初级精母细胞最早出现时间则分别提前2d和5d，且雄性率分别达65.8%和71.3%。研究还发现，来曲唑显著抑制性腺分化过程中Cyp19a1a和foxl2基因的表达[28]。用来曲唑浸泡处理暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）也可降低雌性比例，抑制Cyp19a1a基因的表达。但是暴露起始时间不同，暴露浓度不同，雌性性别比例也所不同。起始时间为10dah，暴露在0.625mg/L浓度组中效果最好，雌鱼完全雄性化[27]。

关于内源性类固醇激素在鱼类性别分化中的作用研究人员提出了2种假说，即平衡假说（Bogart，1987）和缺失假说（Nagahama，2000）。平衡假说基于利用性类固醇激素能成功控制鱼类性别提出的，强调雌激素和雄激素在性分化中的作用，认为鱼类性腺分化方向主要取决于哪一种性类固醇激素占优势。缺失假说认为雌激素是鱼类性别分化的关键因素，在性别决定关键时期若体内有雌激素的合成则发育为雌性，没有雌激素的合成则发育为雄性[5]。蒋小龙等[29]使用50μg/L的E2和MT，进行同时和单独浸泡处理性别决定与分化关键时期（孵化后5d（dah））的遗传全雌（XX）和全雄（XY）的尼罗罗非鱼30d，转移到清水中养殖到120dah。研究发现，MT能诱导XX鱼100%的性逆转，MT+E2则不能诱导XX性逆转，E2能诱导62.5%XY性逆转，MT+E2也能诱导52%的XY性逆转。同时发现在E2处理XY组中，处理5d（dat）只有Dmrt1基因表达;在10dat，Dmrt1和Cypl9ala基因同时表达;在30dat只有Cypl9ala基因表达;而MT处理XX组鱼性逆转过程中，在5dat只有Cypl9ala基因表达;在10dat，Dmrt1和Cypl9ala基因同时表达;在30dat只有Dmrt1基因表达。在115dat（120dah）时，经MT+E2处理的XX或XY诱导组中的雌鱼，血清中含有的E2水平均与对照组雌鱼相似，11-KT水平与对照组雄鱼相似。故研究人员认为在尼罗罗非鱼性别决定与分化关键时期，雌激素对性别具有决定作用。这个结果也为缺失假说提供了有力的证据。

甲状腺对性腺性别分化作用在两栖类已有研究，幼体过程中甲状腺激素的缺失会导致无尾类雌性化[30]。在鱼类中，内源性甲状腺激素在鱼类发育早期性腺表型的形成中起着重要作用，Mukhi[31]用含有100μL/L、250μL/L高氯酸盐和100μL/L高氯酸盐+10nM甲状腺激素（T4）的3种水体处理受精后3d的斑马鱼（Danio rerio），100μL/L、250μL/L高氯酸盐处理组中雌性的性别比例显著提高，并且性别比例呈现浓度依赖性。100μL/L高氯酸盐+10nM T4的处理组中雄性比例显著提高，T4处理可促进雄性精子发生。Sharma等[32]研究了甲状腺激素可以诱导基因型雌性的斑马鱼雄性化的潜在分子机制。用甲状腺素（T4，2nM）和甲巯咪唑（MZ，0.15mM）分别处理受精后3d（3 dpf）斑马鱼30d。在精巢分化早期（25 dpf）和晚期（45 dpf），测定了雄性（Dmrt1、Amh、Ar（androgens receptor））和雌性（Cyp19a1a、Esr1（estrogen receptor gene 1）、Esr2a（estrogen receptor gene 2a）、Esr2β（estrogen receptor gene 2β）分化相关基因，发现T4处理的斑马鱼性腺中Amh和Ar表达的增加，Cyp19a1a、Esr1、Esr2a和Esr2β表达量减少。MZ处理组幼鱼性腺中Amh和Ar表达水平下降，Esr1、Esr2a和Esr2β表达量上升，但是抑制甲状腺通路后，Cyp19a1a基因表达量降低，即MZ无法诱导卵巢分化所必需的Cyp19a1a基因表达上调。然而，在三刺鱼（Gasterosteus aculeatus）中研究发现，长期暴露在高氯酸盐中的雌性三刺鱼体内的甲状腺激素水平降低，性腺发育成既包含卵母细胞，也包含精子发生的细胞的间性性腺。这也是目前第一个研究发现高氯酸盐诱导鱼类雄性化[33]。

2.2 温度对鱼类性别决定及分化的影响 发生在性腺形成前期或性腺分化决定期，此时个体对温度敏感，温度可以改变鱼类基因型决定的性别[6]。研究发现，尼罗罗非鱼约在受精后9d进入热敏期，如果在此时进行一定的温度诱导，可使其发生性逆转。高温可诱导雌性尼罗罗非鱼发生雄性化，其性腺中Cyp19a1a及其转录调控因子foxl2的表达水平显著降低，但精巢发育相关的基因Cyp11β（11beta-hydroxylase）和Dmrt1表达显著上调[34]。王婷茹等[35]研究认为，Dmrt1可通过抑制转录组因子Ad4BP/sf-1（adrenal 4 binding protein/steroidogenic factor 1）的活性間接抑制Cyp19a1a基因的表达。在高温诱导雌性半滑舌鳎性逆转实验中同样发现，性腺中Dmrt1基因表达量上调、未性逆转成功的雌鱼性腺中Dmrt1基因未表达。随后研究人员对高温处理组和对照组的尼罗罗非鱼性腺转录组比较分析发现，多个差异表达基因显著富集到参与性别决定和性腺发育的KEGG通路，如卵巢类固醇激素生成和GnRH信号通路等[36]。

另一重要经济鱼类牙鲆，在其卵巢发育的早期阶段，Cyp19a1a启动子表现出去甲基化，Cyp19a1a基因的表达水平升高。Kitano等[37]研究发现，高温（27℃）处理性别决定期（30～100dah）的牙鲆，雌鱼完全性逆转成雄鱼，性逆转雄鱼的性腺Cyp19a1a基因表达受到抑制。Fan等[38]通过设置高温（27℃）单独诱导组，外源雌激素单独处理组及高温（27℃）+外源雌激素共同处理组，比较性腺中的Cyp19a1a和调控元件nr5a2（orphan nuclear receptor）和nr0b1（nuclear receptor transcription factors DAX-1））表达水平。研究发现，高温环境抑制性别分化时期牙鲆的雌激素水平和Cyp19a1a的表达水平，上调nr0b1的表达水平;E2促进nr5a2的表达。进一步研究发现高温环境，可以抑制牙鲆的Cyp19a1a启动子去甲基化过程，Cyp19a1a启动子的高甲基化通过阻断nr5a2对Cyp19a1a转录活性，从而抑制Cyp19a基因的表达;实验还发现高温可以加剧E2的作用效果。Kitano等[39]研究发现，在高温环境下，用E2处理牙鲆群体，雌激素可以通过调节性别基因的表达，如foxl2，Amh，从而抑制牙鲆雄性化。同时，也进一步证实了雌激素干扰物能回救高温的影响。当然，也有低温诱导雄性比例上升的例子，如红鳍东方鲀的基因型性别决定机制为XX/XY型，但在性腺性别分化期间，通过低温诱导河豚幼鱼，基因型雌鱼可以转变为表现型雄鱼[40]。

Faught E等提出高温是一种热应激源，诱导应激激素的产生[41]。在27℃下饲养的牙鲆幼鱼的皮质醇水平明显高于18℃饲养的幼鱼，添加甲吡酮（皮质醇合成抑制剂）会抑制27℃诱导的雌性牙鲆雄性化。体外培养牙鲆性腺器官，在18℃时，添加皮质醇培养的雌性性腺均表达Amh基因，而foxl2或Cyp19a1a基因则不表达，表明皮质醇在性别分化过程中的雄性化作用[42]。

2.3 其他环境因子 研究发现，缺氧（2.8mg O2 / L）不仅可以破坏性激素代谢，还能改变鱼类的性别分化方向，导致F1代雄性偏多。Wu等[43]研究发现，暴露于缺氧环境下的鲤鱼，性腺发育迟缓。进一步研究发现，长期缺氧环境下鲤鱼的雄性激素、雌性激素和三碘甲状腺氨酸（T3）的水平显著降低，这表明低氧对生殖性能的不利影响是由内分泌紊乱引起的。Lu等[44]研究认为，缺氧是通过作用于鱼类大脑-垂体-性腺（BPG）-肝脏轴上的多个靶点而导致内分泌紊乱。于是他们对多个组织中与生殖内分泌相关的关键基因表达进一步研究，发现大脑中（sGnRH）、垂体（Fshβ和LHβ），性腺（Fshr、LHr，star（steroidogenic acute regulatory），Cyp19a1a，Cyp11a（11 alpha -hydroxylase），Cyp11β和20b-HSD（20-b-hydroxysteroid dehydrogenase））的基因的表达都发生了变化。Cheung等[45]以日本青鳉为模型，首次证明缺氧可以使雌鱼出现性逆转。暴露于缺氧环境下的雌性，超过半数性腺发育为精巢并且出现雄性第2性征（平行四边形的肛鳍和有深度切口的背鳍）。进一步发现，缺氧会抑制原始生殖细胞增殖和vasa基因的表达，上调性别决定位点的DMY基因的表达，并诱导卵巢向精巢分化，出现性逆转。并且研究还发现，在缺氧期间，新生雄性青鳉鱼的数量超过了雌性，Shang等[46]在缺氧下孵育出来的斑马鱼F1代中也观察到类似的现象。

光是重要的环境因子，光谱、光周期和光强是光的三要素。Hayasaka等[47]首次在对日本青鳉的研究中发现，特定波长的辐射（绿光）可以诱导发生性逆转。研究人员发现，在成年青鳉眼中共表达8种视蛋白，但是在性别分化的关键时期（3dah），只有3种绿光视蛋白（RH2（rhodopsinlike with various absorption sensitivities）-A，RH2-B，RH2-C）和2种红光视蛋白（LWS（long wavelength-sensitive）-A/LWS-B）基因表达。进一步实验发现，绿光环境下饲养的15.9%的雌性日本青鳉性逆转，并出现雄性第二性征，产生具有活力的精子，将性逆转的青鳉与正常雌鱼杂交产生全雌的F1代。研究人员推测一方面可能是因为是特定波长的光产生的压力导致日本青鳉皮质醇水平升高，从而抑制Cyp19a1a基因的表达。青鳉研究中发现，在正常的生殖腺发育过程中，正常的雌性生殖细胞数量比雄性多5倍。采用RNA敲除技术降低细胞数量可以实现雌鱼向雄鱼的性别逆转[48]。由此推测，也可能是因为特定波长的辐射产生活性氧导致细胞死亡，性别发生逆转。

3 结语

综上所述，鱼类的性别决定与分化具有很大的可塑性，环境因子确实可以改变鱼类原基因型决定的性腺分化方向。就目前的研究来看，它们通过调控鱼类性别决定分化相关基因的表达和性类固醇激素的水平，来影响性腺的分化。其中，性激素合成途径中的类固醇生成酶（Cyp19a）是环境因素影响鱼类性别决定与分化途径的重要靶点。但是，水环境是一个可变因素较多的外界环境，对性别决定和分化有影响的其他环境因子还有待进一步的研究。同时，各种环境因子（激素、温度、光谱和低氧等）之间既相互独立又相互作用，但是它们之间具体的关系和在性别逆转中扮演的角色，还有待今后作近一步的研究。近年来，随着高通量测序技术的完善和分子生物学和遗传学的研究手段开发与应用，将会有助于研究者更深入地从分子水平解释外界环境因子影响鱼类性别决定和分化机制。通过对环境因素对鱼类性别决定与分化影响的深入研究，将有利于针对不同的鱼类，设计出更为准确、有效且简单环保的人工诱导方式，实现单性养殖，提高经济价值。

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（責编：张宏民）