藜麦芽多肽制备及其应用研究

李可心，潘其迪，衣艳娇，杨倩，贾丽娜，徐慧

（河北农业大学理工学院，河北沧州061000）

藜麦是一种营养丰富的粮食作物，其种子含有丰富的必需氨基酸、矿物质和不饱和脂肪酸[1-4]。1989 年美国国家科学院将藜麦作为植物王国中最好的蛋白质来源[5]。藜麦中蛋白质含量高达12%～23%[6-7]，超过了小麦、大麦等主流谷物中的蛋白质含量[8]。基于其丰富的蛋白质含量，对于多肽的制备具有开发的潜力。多肽具有良好的营养特性，易消化吸收[9]，对降低胆固醇、降血压、促进脂肪代谢、抗疲劳、增强人体免疫力、调节人体生理机能具有辅助治疗作用[10-13]。

现有研究结果表明，藜麦中含有具有抗氧化肽功能的活性肽[14]。田旭静[15]研究发现藜麦多肽含有18 种氨基酸，其还原能力为0.644，对超氧阴离子和羟基自由基具有较好的清除能力。胡洁[16]、黄金[17]等研究结果表明，藜麦在萌芽过程中生物活性成分会显著增加。目前对于藜麦多肽相关功能性食品、功能性添加剂开发较少[18]，藜麦多肽相关产品在市场上仍是一个空缺[4]。因此，本试验通过优化藜麦芽培养工艺条件，培养出富含多肽、营养价值较高的多肽藜麦芽，制备多肽藜麦芽粉，并在此基础上研究多肽藜麦芽粉在饮料中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藜麦：山东老乡生态农业有限公司；氯化钠、硫酸锰、氯化钙、氢氧化钠、硫酸铜、酒石酸钾钠、三氯乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白（分析纯，纯度：98%）：赛国生物试剂公司。

UV-1200 紫外分光光度计：上海美普达仪器有限公司；JRJ300-SH 均质机：上海标本模厂；SC-04 离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；HH-8 电子恒温水浴锅：沃信科技有限公司；HSP-80B 恒温恒湿培养箱：上海秉越电子仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 藜麦芽的培养

样品预处理：取3 g 藜麦，经超纯水清洗后于1%次氯酸钠溶液浸泡10 min，达到杀菌目的，然后用超纯水清洗至pH 值为中性。

藜麦芽培养：课题组前期工作已确定藜麦芽培养液各组分浓度为硫酸锰1.32 mmol/L，氯化钠3.26 mmol/L，氯化钙1.09 mmol/L。取浸泡好的藜麦置于放有上述培养液的烧杯中，于一定温度下水浴一段时间。将藜麦取出平铺入放有双层湿润滤纸的培养皿中，于恒温恒湿培养箱中（相对湿度为80%～90%）25 ℃避光培养一段时间，每12 h 喷洒一次超纯水（达到滤纸饱和为宜），以保持藜麦湿润。

储存：将藜麦芽取出用超纯水清洗，置于-80 ℃冰箱，并在试验期间取出。

1.2.2 多肽含量的测定

1.2.2.1 标准曲线的绘制

以牛血清白蛋白为标准品配置不同浓度标准蛋白溶液，取1 mL 标准蛋白溶液加4 mL 双缩脲试剂，充分摇匀后37 ℃水浴20 min 后于540 nm 波长下比色测定。

1.2.2.2 样品多肽含量的测定

参考温焕斌[19]检测方法进行。取1 g 藜麦芽于研钵中，加入5 mL 超纯水研磨，4 000 r/min 下离心15 min，弃去沉淀得上清液①。取上清液①2 mL 加入2 mL 三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）12 000 r/min 离心 15 min，弃去沉淀得上清液②，取1 mL 上清液②加入4 mL 双缩脲试剂，充分摇匀后37 ℃水浴20 min 后于540 nm波长下比色测定。

1.2.2.3 计算公式

样品中多肽含量/（mg/g）=2 CV/m

式中：C 为标准品质量浓度，mg/mL；V 为加入超纯水体积，mL；m 为样品质量，g；2 为稀释倍数。

1.2.3 单因素试验

在预试验的基础上，通过单因素试验探讨浸泡温度、浸泡时间、培养时间3 个因素对藜麦芽中多肽含量的影响。

固定浸泡时间为4 h，培养时间为48 h，浸泡温度分别为 20、25、30、35、40 ℃，培养藜麦芽。

固定培养时间为48 h，浸泡温度为25 ℃，浸泡时间分别为 2、4、6、8、10 h，培养藜麦芽。

固定浸泡温度为25 ℃，浸泡时间为4 h，培养时间分别为 24、48、72、96、120 h，培养藜麦芽。

1.2.4 正交试验优化

在单因素的基础上，以培养时间、浸泡时间、浸泡温度为影响因素，进行三因素三水平正交优化试验设计。

1.2.5 多肽藜麦芽粉的制备

取多肽藜麦芽按料水比1 ∶12（g/mL）进行低温打浆（水温4 ℃），然后进行冷冻干燥，收集冷冻干燥产物并进行粉碎得到多肽藜麦芽粉。

1.2.6 多肽藜麦芽粉在饮料中的应用

将1.2.5 中制备得到的多肽藜麦芽粉按一定质量体积比与纯净水调配得到多肽藜麦芽饮料，对多肽藜麦芽粉不同添加量的多肽藜麦芽饮料进行初步感官评价。

1.2.7 质量指标检测

参考GB/T15672-2009《食用菌中总糖含量的测定》[20]测定总糖含量；参考双缩脲比色法测定多肽含量；参考GB4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[21]检测菌落总数；参考GB 4789.3-2016 《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[22]检测大肠菌群；参考GB 29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》[23]检测致病菌。

1.2.8 统计分析

每个样品进行重复3 次平行试验，汇总数据并计算平均值及其标准偏差，单因素试验内计算组内差异显著性。运用Excel 2010 进行数据分析，运用IBM SPSS Statistics 25 进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

牛血清蛋白标准曲线见图1。

图1 牛血清蛋白标准曲线Fig.1 Bovine serum albumin standard curve

分别配制 20、30、40、50、60、70 mg/mL 牛血清蛋白标准溶液，按1.2.2.1 的方法测定吸光度。牛血清蛋白标准溶液浓度为横坐标x，吸光度为纵坐标y，制作标准曲线见图1，所得回归方程y=0.009 5x+0.250 5，R2=0.987 4。

2.2 单因素试验结果

浸泡温度对多肽含量的影响见表1。

表1 浸泡温度对多肽含量的影响Table 1 Effect of soaking temperature on peptide content

由表1 可知，浸泡温度对多肽含量的影响显著（p＜0.05）。随浸泡温度的升高，多肽含量先升高后降低。多肽富集最佳浸泡温度范围为20 ℃～30 ℃。这可能是由于温度过高抑制种子呼吸，氧气进入种子缓慢使许多耗氧反应受抑制，新陈代谢缓慢，生命活动所需的中间物质的形成受抑制，表现为多肽含量下降。温焕斌[19]研究发现，合适的浸泡温度有利于提高藜麦芽生命活力从而提高蛋白酶活力。当温度在25 ℃前后时，对于藜麦芽萌发较适宜，此时可能蛋白酶活力较高，有利于蛋白质向多肽的转变，利于多肽的富集。浸泡时间对多肽含量的影响见表2。

表2 浸泡时间对多肽含量的影响Table 2 Effect of soaking time on peptide content

从表2 可以看出，随浸泡时间的延长，多肽含量先增加后降低。当浸泡时间在2 h～4 h 范围内时，随浸泡时间的延长，多肽含量显著增加，浸泡时间对多肽含量影响在4 h～6 h 范围内不显著，随浸泡时间的进一步延长，多肽含量呈下降趋势。浸泡时间过短会导致种子吸水不充分，发芽过程中容易失水，而长时间的浸泡易造成种子腐烂，经试验中观察发现，浸泡时间超过6 h～8 h，种子表面开始有滑腻感，藜麦种子较小，吸水较快，不适合长时间浸泡。

培养时间对多肽含量的影响见表3。

表3 培养时间对多肽含量的影响Table 3 Effect of culture time on peptide content

由表3 可知，随培养时间的延长，多肽含量先增加后降低，培养时间对多肽含量的变化影响显著（p＜0.05）。藜麦芽萌发初期种子活化，耗能较少，开始进入萌发阶段胚芽长出，形成新的芽体组织，芽体急速生长，细胞大量形成，伴随着蛋白质的参与，为了维持这些新形成的细胞内的生命活动，储能大分子物质大量转化为中间产物，所以检测到的多肽含量升高，随培养时间的延长开始进行物质的合成消耗已形成的中间产物导致多肽含量降低，在培养时间为48 h 时，多肽含量达到最大值。

2.3 正交优化试验结果

正交试验方案及试验结果见表4。

表4 正交试验方案及试验结果Table 4 Orthogonal test plan and test results

由表4 可知，以多肽含量为指标，各因素的影响依次为C＞B＞A，即培养时间对多肽含量的影响最大，其次是浸泡时间，浸泡温度对藜麦芽多肽含量的影响最小。由正交试验结果分析确定最佳培养条件：A2B2C2，即培养时间为48 h，浸泡时间为4 h，浸泡温度为25 ℃。

2.4 验证试验

为验证正交试验所得结果的可靠性，在上述最佳培养条件下进行3 次平行试验并测定藜麦芽中多肽含量。经测定，所得藜麦芽中多肽含量为（12.4±1.13）mg/g，大于（11.45±0.88）mg/g，所以最佳培养条件为培养时间为48 h，浸泡时间为4 h，浸泡温度为25 ℃。

2.5 多肽藜麦芽粉质量指标检测结果

微生物检验结果如表5 所示。

表5 微生物检验结果Table 5 Microbiological test results

多肽藜麦芽粉中菌落总数、大肠菌群数、霉菌数均为0 CFU/mL，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均未检出，说明本产品符合国家卫生标准。营养指标检测结果见表6。

表6 营养指标检测结果Table 6 Test results of nutritional indicators

2.6 多肽藜麦芽粉在饮料中的应用

料水比对感官评定的影响见表7。

表7 料水比对感官评定的影响Table 7 Effect of water-to-water ratio on sensory evaluation

由2.5 检测结果得出多肽藜麦芽粉末可以添加到饮料中作为营养型添加剂，从表7 中可以看出，料水比为10 g/100 mL 时达到较好的溶解度，口感顺滑，添加量过少或者过多都会影响饮料的状态和口感。

3 结论

多肽的营养功能性受到消费者的日益瞩目，相关产品的研发具有良好的应用前景。本研究以白藜麦为原料，藜麦萌发过程中蛋白质向多肽的转变，制备多肽藜麦芽，优化得到最佳多肽藜麦芽制备工艺为浸泡温度25 ℃，浸泡时间4 h，培养时间48 h。在此工艺条件下，得到藜麦芽中多肽含量为（12.4±1.13）mg/g。将多肽藜麦芽制成多肽藜麦芽粉，作为营养型添加剂添加到食品中，可以提高食品中多肽含量，提高食品的营养功能性。