沉香的高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱数字化指纹图谱研究

吴惠勤，黄 芳，黄晓兰，罗辉泰，谢淑桐，周 熙

(中国广州分析测试中心 广东省分析测试技术公共实验室，广东 广州 510070)

沉香由瑞香科植物白木香树产生，主产地在中国南方及东南亚，是一种珍贵的中药材[1]。现代研究表明，沉香在治疗消化系统疾病、呼吸系统疾病、心脑血管疾病、神经系统疾病以及外科、妇科、儿科、五官科和皮肤科疾病等方面均有显著疗效，在抗肿瘤、抗风湿病以及美容等方面亦有较好的作用[2-5]。可见，沉香的药理作用和临床应用范围十分广泛，具有广阔的开发应用前景。

有研究表明沉香中的特征性成分主要由倍半萜类挥发性成分(占52%)和2-(2-苯乙基)色酮类难挥发性成分(占41%)[6]组成。沉香的气味主要由挥发性成分构成，通常采用气相色谱-质谱(GC-MS)法进行成分研究[7-9]。吴惠勤等[10-12]采用固相微萃取/气相色谱-质谱(SPME/GC-MS)测定了沉香的香气成分，基本阐明了挥发性的化学成分。对于难挥发性成分的研究，主要采用液相色谱及液相色谱-质谱法[13-14]，杨锦玲等[15]测定了不同结香方法所得沉香的色酮含量，发现其含量差异大。有学者研究沉香的液相色谱指纹图[16-18]，发现药材产地、结香方法和时间均可导致成分差异和质量差异。现行《中国药典》[19]规定沉香的定量指标为沉香四醇，另外规定沉香的特征液相色谱图中须含有6个特征峰，其中1、3、5号峰给出了化合物名称，其余均为未知化学成分。中药发挥药效的物质基础是化学成分，目前沉香中有很多难挥发成分的化学结构尚不清楚，给中药的质量评价和质量控制带来困难，影响中药的现代化进程。为研究沉香中这些成分的化学结构，本研究采用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用(HPLC-Q-TOF-MS)法测定其组成，同时采集色谱及质谱数据，得到高分辨飞行时间质谱(TOF-MS)总离子流色谱图和液相色谱-紫外检测图(HPLC-UV)，用Qualitative Navigator B.08.00软件识别总离子流色谱图中各色谱峰的精确质量数(精确至小数点后第四位)，并标注在色谱峰上，即得到每个色谱峰具有唯一性的数字化信息。进一步通过计算机软件推算出每个精确质量数的元素组成(分子式)，结合二级质谱子离子的质谱数据及文献报道推断出化学结构，从沉香中共鉴定了30个难挥发性成分，达到以数字化形式表征化学成分的目的。本文首次提出并构建了沉香的数字化的HPLC-UV/TOF-MS指纹图，对色谱图中每种化学成分给出了类似于身份证的数字化信息，具有唯一性，且主要成分均鉴定出化学结构，全面地表征了沉香的物质组成。本研究为沉香的质量综合评价提供了可行方法，也为药理、药效研究及质量标准研究奠定了基础。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1290 HPLC-6540-Q-TOF-MS配有双喷射流电喷雾离子源(美国安捷伦公司)；赛多利斯TP-114电子天平(美国Sartorious公司)；KQ2200型台式机械超声波清洗器(东莞市超声波设备有限公司)；甲醇、乙醇、乙腈(HPLC级，德国Merck公司)，实验用水为二次蒸馏水，甲酸(阿拉丁试剂有限公司)。沉香四醇对照品(批号19020131)、沉香对照药材(批号121222-201203)均购于中国食品药品检定研究院;沉香样品由江门粤怡沉香科技公司提供。

1.2 实验方法

将沉香药材粉碎，精密称取0.2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入10 mL乙醇，称定质量，浸泡0.5 h，超声处理(功率250 W，频率40 kHz ) 1 h，放冷，再次称定质量，用乙醇补足损失的质量，摇匀，静置，取上清液过滤，滤液待上机分析。

1.3 液相色谱条件

色谱柱：Phenomenex luna C18(25 cm×4.6 mm×5 μm)；流动相：以乙腈为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B。梯度洗脱程序：0～10 min，15%～20%A；10～19 min，20%～23%A；19～21 min，23%～33%A；21～39 min，33%A；39～40 min，33%～35%A；40～50 min，35%A；50.1～60 min，95%A；60～66 min，95%～15%A。流速为0.7 mL/min，紫外检测波长为252 nm。

1.4 质谱条件

离子源为Agilent双喷Jet Stream源(Dual Jet Stream ESI)，正离子模式采集，干燥气(N2)温度：350 ℃，雾化气(N2)压力：275.8 kPa，流速：8 L/min，鞘气温度：350 ℃，流速：11 L/min，毛细管电压：3 000 V，毛细管出口电压(Fragmentor)：110 V，锥孔电压(Skimmer)：65 V，八极杆电压：750 V，采集模式为自动MS/MS，扫描范围：m/z80～1 100 u；参比离子：m/z121.050 9、922.009 8。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

沉香在正离子模式扫描过程中各成分均形成[M+H]+的准分子离子峰，二级质谱碎裂生成子离子；负离子模式扫描过程中各成分丢失质子形成[M-H]-的准分子离子峰，但响应值比正离子模式低，因此本实验采用正离子扫描模式进行检测。

2.2 紫外色谱图及总离子流图的测定

沉香的前处理方法和液相色谱条件参照《中国药典》2015版[19]沉香项下，采用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪测定，同时采集紫外检测数据，样品的高分辨质谱总离子流(TIC)图见图1。与紫外色谱图(图略)相比，相同保留时间色谱峰的丰度有较明显差异，UV图中部分峰明显偏低，主要是由于检测机理不同使得响应强弱不同所致。

图1 沉香的质谱总离子流图

2.3 精确质量数的识别及数字化指纹图的建立

经高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪测得沉香的总离子流质谱数据，对图1中各色谱峰进行精确质量数识别，以该色谱峰丰度最高的质谱峰所对应的精确质量数为该峰的准分子离子峰(母离子)，每个母离子均为[M+H]+离子，因此以该准分子离子的精确质量数表示该色谱峰的质量数(精确到小数点第4位)，识别出TIC图中30个色谱峰的精确质量数。由于UV图及TIC图中保留时间相同的峰为同一物质，因此可将精确质量数标注在UV图上，然后确定各精确质量数的分子式，并进一步鉴定其化学结构，从而得到数字化的色谱-质谱指纹图(见图2及图3)，可表征沉香的化学成分。

图2 沉香的HPLC-TOF-MS数字化指纹图谱

图3 沉香的HPLC-UV数字化指纹图谱

图4 2-(2-苯乙基)色酮类成分的裂解途径

2.4 数字化指纹图中成分鉴定

进一步分析“2.3”的沉香色谱-质谱指纹图，利用仪器定性分析软件对各峰对应的精确质量数进行分析，推测出最有可能的分子式并确定离子的状态，然后逐个研究其二级质谱的碎片离子、丢失基团、质谱裂解规律，推断化合物的可能结构式，用对照品进行质谱测定，确证各个成分的化学结构。最终，从沉香中共鉴定出30个化学成分，结果见表1。

研究结果显示，沉香的主要成分为2-(2-苯乙基)色酮类物质，通过对该类化合物的裂解机理进行研究，发现其母核结构的裂解规律(见图4)。以下对5、18、28号色谱峰进行了详细的质谱解析。

5号峰(保留时间18.49 min)的一级质谱图见图5A，准分子离子峰[M+H]+的精确质量数为319.118 2，推断其分子式为C17H18O6，误差在±5×10-6范围内；[M+H]+319.118 2的二级质谱图见图5B，其主要生成碎片离子：m/z301.107 1、283.096 8、255.101 8、227.106 4、192.041 8、164.046 6、105.069 6、91.054 1等。质谱裂解规律为：准分子离子峰m/z319.118 2中的氢重排到羟基上，氧原子上的1个键发生断裂，中性丢失1分子H2O ，形成m/z301.107 1[M+H-H2O]+碎片离子，然后另1个氢重排到另1个羟基上，氧原子上的1个键发生断裂，再中性丢失1分子H2O形成m/z283.096 8[M+H-2H2O]+碎片离子；m/z283.096 8先发生i诱导断裂，然后发生α断裂，中性丢失1分子CO，形成m/z255.101 8[M+H-2H2O-CO]+碎片离子；准分子离子m/z319.118 2环上游离基中心提供1个奇电子与邻接原子形成1个新键，同时该α原子的另一个键断裂(α断裂)(CH2-CH2)，形成m/z227.106 4和m/z91.054 1的碎片离子。m/z227.106 4氢重排到羟基上，氧原子上的1个键发生断裂，中性丢失2分子 H2O，形成m/z192.041 8的碎片离子。m/z255.101 8[M+H-2H2O-CO]+环上游离基中心提供1个奇电子与邻接原子形成1个新键，同时该α原子的另一个键断裂(CH2-CH2)，形成m/z164.046 6和m/z105.069 6的碎片离子。综合以上信息推断5号峰(分子量为318)的化学成分为沉香四醇，精确分子量为318.110 3，分子式为C17H18O6，其裂解机理见图6。

图5 5号峰的一级质谱图(A)与精确质量数319.118 2峰的二级质谱图(B)

图6 沉香四醇的裂解机理

18号峰(保留时间为31.95 min)的一级质谱图见图7A，准分子离子峰[M+H]+的精确质量数为337.083 2，推测其分子式为C17H17ClO5，误差在±5×10-6范围内；[M+H]+337.083 2的二级质谱图见图7B，其主要生成碎片离子：m/z319.073 4、301.062 4、283.096 2、265.085 4、192.041 2、91.053 6等。质谱裂解规律为：准分子离子峰m/z337∶m/z339 的丰度比约3∶1，可见分子中含有1个氯原子，准分子离子m/z337.083 2环上游离基中心提供1个奇电子与邻接原子形成1个新键，同时该α原子的另1个键断裂(α断裂)(CH2-CH2)，形成m/z319.073 4和m/z91.053 6的碎片离子。准分子离子m/z337.083 2氢重排到羟基上，氧原子上的1个键发生断裂，中性丢失1分子 H2O，形成m/z319.073 4 [M+H-H2O]+碎片离子，随后另1个氢重排到另1个羟基上，氧原子上的1个键发生断裂，又中性丢失1分子 H2O，形成m/z301.062 4[M+H-2H2O]+碎片离子；m/z319.073 4氢重排到氯原子上，氯原子上1个键发生断裂，中性丢失1分子HCl，形成m/z283.096 2[M+H-H2O-HCl]+碎片离子;m/z301.062 4氢重排到氯原子上，氯原子上1个键发生断裂，中性丢失1分子HCl，形成m/z265.085 4[M+H-2H2O-HCl]+碎片离子；碎片离子m/z283.096 2环上游离基中心提供1个奇电子与邻接原子形成1个新键，同时该α原子的另1个键断裂(二环之间的CH2-CH2键发生断裂)，形成m/z192.041 2、91.053 6的碎片离子。综合以上信息并结合文献分析，推断该成分为8-氯-2-(2-苯乙基)-5，6，7-三羟基-5，6，7，8-四氢色酮，其裂解机理见图8。

28号峰(保留时间为46.17 min)的一级质谱图见图9A，准分子离子峰[M+H]+的精确质量数为283.095 9，推测分子式为C17H14O4，误差在±5×10-6范围内；[M+H]+283.095 9的二级质谱图见图9B，其主要生成碎片离子：m/z255.100 6、227.106 1、192.041 3、164.046 6、123.041 7、105.069 2、91.053 7。质谱裂解规律为：准分子离子m/z283.095 9环上游离基中心提供1个奇电子与邻接原子形成1个新键，同时该α原子的另1个键断裂(α断裂)(CH2-CH2)，形成m/z192.041 3和m/z91.053 7的碎片离子；准分子离子m/z283.095 9先发生i诱导断裂，然后发生α断裂，中性丢失1分子CO，形成m/z255.100 6[M+H-CO]+碎片离子，再发生i诱导断裂，随后发生α断裂，又失去1分子CO，形成m/z227.106 1[M+H-2CO]+碎片离子；m/z227.106 1[M+H-2CO]+的 CH2-CH2键发生α断裂，形成m/z123.041 7和m/z105.069 2的碎片离子；m/z255.100 6[M+H-CO]+环上游离基中心提供1个奇电子与邻接原子形成1个新键，同时该α原子的另1个键断裂(α断裂)(CH2-CH2)，形成m/z164.046 6的碎片离子。综合以上信息并结合文献分析，推测该成分为6,7-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮，其裂解机理见图10。

图7 18号峰的一级质谱图(A)与精确质量数337.083 2峰的二级质谱图(B)

图8 8-氯-2-(2-苯乙基)-5，6，7-三羟基-5，6，7，8-四氢色酮的裂解机理

Fig.8 Pyrolysis mechanism of 8-chloro-2-(2-phenylethyl)-5,6,7-trihydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone

图9 28号峰的一级质谱图(A)与精确质量数283.095 9峰的二级质谱图(B)

图10 6,7-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮的裂解机理

表1 沉香指纹峰的精确质量数及其化学成分

(续表1)

PeakNo.Retentiontime(min)Accuratemassnumber(m/z)Fragmentions(m/z)StructuralformulaCompoundRelativecontent(%)1831.95337.0832319.0734,301.0624,265.0854,91.0536C17H17ClO58-Chloro-2-(2-phenylethyl)-5,6,7-trihydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone(8-氯-2-(2-苯乙基)-5,6,7-三羟基-5,6,7,8-四氢色酮)1.611932.93313.1068207.0641,107.0480C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-moneorisomer(6,4′-二羟基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或异构体)0.202034.41331.1169313.1076,285.1121,121.0647,91.0539C18H18O65,6-Epoxy-7,8-dihydroxy-2-[2-(4-methoxybenzene)ethyl]chromoneorisomer(5,6-环氧-7,8-二羟基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮或异构体)1.082135.28301.1063283.0859,255.1009,164.0462,91.0539C17H16O55,6-Epoxy-7,8-dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chro-mone(5,6-环氧-7,8-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮)8.712236.78237.1842219.1732,163.1105,91.0531C14H20O35,6,6-Trimethyl-5-(3-oxobutyl-1-ene)-1-oxazolo[2.5]octane-4-one(5,6,6-三甲基-5-(3-氧代丁基-1-烯基)-1-氧杂螺[2.5]辛-4-酮)0.342337.53313.1067177.0542,137.0591C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-moneorisomer(6,4′-二羟基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或异构体)0.242439.86313.1077137.0605,122.0356C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-moneorisomer(6,4′-二羟基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或异构体)0.172542.24313.1061163.0386,121.0566,91.0541C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-moneorisomer(6,4′-二羟基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或异构体)0.322643.71283.0965255.0994,227.1049,91.0536C17H14O46,7-Dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chromoneiso-mer(6,7-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮异构体)0.752745.23313.1067163.0387,121.0644C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-mone(6,4′-二羟基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮)14.112846.17283.0959164.0466,91.0537C17H14O46,7-Dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chromone(6,7-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮)29.242947.93313.1067121.0542,91.0476C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chromoneorisomer(6,4′-二羟基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或异构体)0.353049.78283.0959192.0417,153.0181,126.0310,91.0540C17H14O46,7-Dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chromoneisomer(6,7-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮异构体)0.51

表2 沉香6个特征峰的化学成分

图11 沉香的特征色谱图

2.5 化学结构验证

为验证“2.4”中所鉴定化学结构的可靠性，在相同条件下测定色谱保留时间及质谱数据，若该成分与其对照品的保留时间及准分子离子峰、二级特征离子完全一致，则可判定为该化合物。如鉴定出质量数319.118 2为沉香四醇，以标准品作对照，相同条件下测定沉香四醇对照品的色谱保留时间及质谱数据。结果显示，沉香四醇对照品及沉香样品的保留时间均为12.88 min，且沉香四醇对照品的二级质谱图与图5B中的质谱离子完全相同，证明该峰为沉香四醇，结果可靠。

2.6 2015版《中国药典》沉香项下指定特征成分的鉴定

2015版《中国药典》沉香项下指定特征图谱(见图11)中的6个特征峰，只明确了第1、3、5号峰的化学名称，与本文的数字化指纹图谱进行对比(见图3)，结果显示此3个成分与鉴定一致；另3个峰的鉴定结果见表2，可为药典标准的提升提供科学数据。

3 结 论

本文首次采用HPLC-Q-TOF-MS技术研究建立了沉香的色谱-质谱数字化指纹图谱。沉香色谱图中的每个峰均给出了精确质量数及二级质谱数据，并鉴定了其中30个成分的化学结构，包括《中国药典》沉香项下特征图谱中的未知成分。本方法系统鉴定了沉香中难挥发物质的化学成分，所构建的色谱-质谱数字化指纹图谱能全面反映沉香的物质成分，为沉香的药理、药效和质量标准研究提供了科学数据。