马铃薯茎叶青贮时间对厌氧发酵产沼气性能的影响

付龙云， 李 彦， 赵自超， 王艳芹， 袁长波， 井永苹

(1.山东省农业科学院农业资源与环境研究所， 济南 250100； 2.农业农村部山东耕地保育科学观测实验站， 济南 250100)

随着我国农牧业转型升级逐渐深入，效率更高的集约化、规模化生产方式日益得到推广，比例不断提升。然而，与此相对应的是秸秆、尾菜、禽畜粪便等农牧业废弃物集中大量产生，极易超出当地自然环境的承载能力，引发一系列生态环境问题。厌氧沼气发酵是一种有效的废弃物资源化利用方式，该方式既可产出大量沼气，又可产生有肥料利用价值的沼渣、沼液，实现对农牧业废弃物的高效利用[1]。然而由于农牧业生产的季节性、地区性等不确定性因素较多，众多沼气工程的原料来源往往不能得到长期稳定保证，易出现开工不足、生产潜力无法发挥等问题，严重影响了行业健康发展[2]。

作为沼气技术领先者，德国沼气产业发展多有值得我国借鉴之处。德国纬度与我国黑龙江省相当，多数农作物为“一年一熟”，青贮玉米和其它谷物分别约占沼气发酵原料的70%和8%，青贮是其保存植物有机成分、确保原料来源稳定的主要方式[3]。我国地域更为广阔、气候多样，虽然沼气工程原料来源与德国存在较大差异，但青贮亦可作为秸秆、尾菜等众多植物性原料保存有机成分的重要方式。

青贮过程中有机物料的成分、品质等均会随时间延长而发生不同变化，进而对厌氧发酵产沼气性能产生重要影响。Herrmann等对玉米、高粱、小麦、黑麦等四种作物进行不同时长的青贮后，分别用于厌氧沼气发酵，发现青贮时间对不同类型原料单位产甲烷量的影响不尽相同：玉米、高粱随青贮时间的延长，单位产甲烷量逐渐提高；而小麦、黑麦的单位产甲烷量则随青贮时间延长，呈先升高、又降低的趋势[4]；Neureiter[5]等以全株玉米为原料，研究了乳酸菌制剂、淀粉酶、丁酸梭菌等不同添加剂和青贮时间对厌氧发酵产沼气的影响，发现虽然青贮过程中有机成分有一定损失，但产甲烷效率却有提高；Pakarinen[6]等对混播草和黑麦分别进行不同时间的青贮后用于厌氧发酵，发现青贮物料组虽然相对于新鲜物料组单位产气量有所下降，但仍能有效保存大部分有机物质。青贮过程中有机物质总量逐渐减少的同时，可溶性碳水化合物(Water Soluble Carbohydrate，WSC)、粗蛋白(Crude Protein，CP)、粗脂肪(Ether Extract，crude fat，EE)和中性洗涤纤维(Neutral Detergent Fiber，NDF)等不同组分也会发生不同转变，而由于沼气微生物对各种组分分解利用的难易程度不同，即表现为不同物料厌氧发酵产沼气性能的差异。

马铃薯是一种重要的粮食和经济作物，我国马铃薯种植范围和产量均居于世界首位，多年来在内蒙、黑龙江等地形成了集中连片的规模化种植区域[7]。然而，规模化种植在提高生产效率、增加农民收入的同时，也会造成马铃薯茎叶等副产品短时间内的大量累积，如果不加处理，任由其堆放在田间地头腐败变质，不但污染了环境，而且浪费了宝贵的生物质资源。马铃薯茎叶生物量与营养性块茎相当，干物质中WSC含量为2%～7%，CP含量为11%～26%，EE含量为2.5%～4.8%，NDF含量为28%～47%，青贮可以较大程度的保存马铃薯茎叶有机物质，并改善成分、结构特性，进而应用于饲料化、能源化等方向。杨闻文等以米糠、玉米秸等为添加物，徐亚姣等通过添加酶制剂、乳酸菌等及降低物料含水率，均不同程度地提高了马铃薯茎叶的青贮品质[8-9]。但需要注意的是，以厌氧沼气发酵为应用目标进行青贮时，技术侧重点与饲料加工并不相同，动物营养、适口度、风味等饲料评定的标准往往并不适用于厌氧沼气发酵。特别是为保障沼气工程原料的周年均衡供应，青贮时间对不同原料青贮品质及产气性能的影响可能需要重新考量[10]。

由于缓冲能值强、WSC含量较低、含水量较高等原因，马铃薯茎叶单独自然青贮往往品质不佳，易出现pH值过高、乳酸含量过低和腐败等情况。实践中常常需要使用不同类型的青贮添加剂或与其它植物原料混合青贮，以调控青贮进程和提高青贮质量，有研究表明，丙酸具有抗真菌、抑制腐败、促进乳酸菌生长等优良作用[11-12]。综上所述，本研究以丙酸为青贮添加剂，对新鲜马铃薯茎叶进行不同时长的青贮，探究青贮时间对马铃薯茎叶厌氧发酵产沼气性能的影响，以促进这类生物质资源的有效利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

马铃薯茎叶取自山东省滕州市马铃薯种植区，采收时间为6月份马铃薯收获季；厌氧沼气发酵接种物沼渣取自山东省某猪场厌氧沼气发酵装置，4℃冷藏，使用前35℃温箱复苏2 h；丙酸为分析纯产品，购自国药集团化学试剂有限公司。总固体(Total Solid，TS)、挥发性固体(Volatile Solid，VS)、碳氮比(C/N)等马铃薯茎叶及接种物原料特性如表1所示。

表1 厌氧沼气发酵物料基本特性 (%)

1.2 试验设计

1.2.1 青贮试验设计

试验设置4个青贮组和1个对照组，分别为马铃薯茎叶青贮30 d，60 d，120 d，180 d和新鲜茎叶，每组设置3个平行，具体为：将刚采收的马铃薯茎叶切割粉碎至1～3 cm的片段，按0.2%(wt/wt)的比例加入丙酸并混合均匀，装入聚乙烯自封袋，每袋1000 g，共15袋，抽真空后密封，室温条件下(22.0℃～27.0℃)分别贮存规定时间(30～180 d)后，取样测定样品理化性质，其余物料于-20℃统一冻存备用。

1.2.2 厌氧沼气发酵试验设计

厌氧沼气发酵试验设置5个试验组，发酵原料分别为青贮30 d，60 d，120 d和180 d的马铃薯茎叶及新鲜茎叶(对照组)，分别记为T1，T2，T3，T4和CK，每组设置3个平行，具体为：试验采用批式发酵，厌氧发酵装置由发酵瓶、乳胶连接管和集气袋组成，发酵瓶为容积为2.5 L的具塞玻璃瓶，塞上打孔并以玻璃管、乳胶连接管与集气袋连接；不同青贮时间的马铃薯茎叶解冻恢复至室温，统一设置各组初始TS为5%(以马铃薯茎叶计)，各组厌氧沼气发酵接种物用量均为500 g，加无菌水补足至2000 mL，物料组成详见表2所述；充分混匀各组物料、接种物，一次性加入发酵瓶，向顶部空间吹入高纯N2持续2 min后迅速塞紧胶塞，尽量排除残存空气；将发酵瓶连接集气袋后放入35℃恒温培养箱，进行周期为40 d的厌氧沼气发酵。实验周期内，每天人工振荡发酵瓶2次，每天定时收集气体测定产气量、甲烷浓度等指标，每隔3天抽取发酵液测定pH值等指标。

表2 厌氧沼气发酵物料的组成 (g)

1.3 测定指标与方法

TS和VS采用烘干失重法测定；总碳使用德国耶拿multi C/N TOC型总有机碳/有机氮分析仪测定；WSC采用硫酸-蒽酮比色法测定[13]；氨氮(Ammonia Nitrogen, AN)、总氮(Total Nitrogen，TN)、CP使用瑞士布琦Kjel master K-375型凯氏定氮仪测定；EE采用乙醚索氏抽提法测定[14]；NDF采用范式洗涤纤维法测定[15]；沼气产量使用德国RitterTG1型湿式气体流量计测定；pH值使用上海雷磁PH-3C型pH计测定，其中青贮物料pH值的测定：取样品20g，加入180g去离子水，匀浆器打匀、过滤后测定；甲烷含量使用北京普析GC1100型气相色谱仪测定；乳酸(Lactic Acid, LA)使用日本岛津10A型高效液相色谱测定；乙酸(Acetic Acid, AA)、丙酸(PropanoicAcid, PA)、丁酸(Butyric Acid, BA)含量使用日本岛津GC2014型气相色谱仪测定。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2013和Origin 2018软件进行数据计算和绘图，采用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 马铃薯茎叶成分随青贮时间的变化

由表3可见，青贮30 d，60 d，120 d和180 d马铃薯茎叶总固体含量分别为13.42%±0.02%，13.25%±0.06%，12.94%±0.05%和12.74%±0.04%，分别比新鲜马铃薯茎叶降低1.61%，2.86%，5.13%和6.60%，挥发性固体含量分别为88.50%±0.23%，87.92%±0.19%，85.38%±0.15%和83.10%±0.24%，分别比新鲜马铃薯茎叶降低0.80%，1.45%，4.29%和6.85%，说明随青贮时间延长，单位质量马铃薯茎叶的总固体和挥发性固体损失逐渐增多；WSC是植株中较易被微生物分解利用的物质，青贮过程中WSC含量下降显著(p<0.05)，青贮30 d,60 d,120 d和180 d时WSC含量分别降低21.62%,37.84%,46.33%和50.77%；本研究的青贮过程中CP,EE含量存在先降低又升高的现象，该现象可能与物料分解、青贮微生物生长积累等因素有关，相比新鲜马铃薯茎叶，青贮30 d,60 d,120 d,180 d时CP和EE变化幅度分别为-6.00%,3.38%,4.42%,5.24%和-6.82%,-3.06%,-0.71%,1.14%；NDF为包含半纤维素、纤维素、木质素等的植株结构部分，青贮30 d, 60 d,120 d和180 d时NDF分别降低11.82%,12.69%,13.38%和13.47%，含量逐渐降低。

表3 青贮时间对马铃薯茎叶成分的影响 (%)

2.2 青贮过程中pH值、有机酸和氨氮/总氮比值变化

如表4所示，随青贮时间延长，青贮体系pH值由6.25±0.00迅速降低至4.18±0.03后逐渐稳定且存在一定波动，至青贮180 d试验结束时pH值为4.32±0.03；乳酸是缺氧条件下乳酸菌等青贮微生物的主要代谢产物，本试验中，青贮0 d～120 d内乳酸含量变化均不显著(p>0.05)，180 d时有显著下降(p<0.05)；试验周期内，乙酸含量随时间延长逐渐增加，特别是在试验后期(180 d)时增长最为显著(p<0.05)；丙酸为本试验主要添加的化学物质，随试验进行含量逐渐降低，60 d,120 d和180 d时分别比30 d时降低14.18%,19.45%和37.25%；丁酸是青贮中需要尽量避免生成的物质，本研究共180 d的试验周期内未检测到丁酸的生成；青贮中氨氮主要由物料中蛋白质、多肽、氨基酸等含氮物质分解产生，氨氮与总氮的比值(AN/TN)可反映这些含氮物质的分解情况，本试验中AN/TN呈逐渐升高的趋势，其中30 d～60 d时AN/TN变化不显著(p>0.05)，其它时间段AN/TN变化较明显(p<0.05)。

表4 青贮过程中pH值、有机酸和氨氮/总氮比值变化

2.3 厌氧发酵沼液pH值变化

厌氧发酵过程中沼液pH值的变化见图1，各处理组pH值均在试验开始后迅速下降，第6天时达到最低点，CK对照组最低pH值为5.91，而以青贮马铃薯茎叶为原料的T1，T2，T3和T4试验组最低pH值分别为5.66，5.45，5.73，5.70，均显著低于CK组，其中T2试验组降幅最大；此后在发酵系统中氨氮等缓冲因素作用下，各处理组pH值逐渐上升至7.5以上，并存在一定波动，试验开始的21d后T1，T2，T3和T4试验组pH值均高于CK对照组。说明青贮在降低马铃薯茎叶厌氧发酵最低pH值后，也能够提高发酵后期pH值。

图1 厌氧发酵过程pH值变化

2.4 原料青贮时间对沼气日产量的影响

如图2所示，40 d的试验周期内，随发酵时间推移，各处理组产气均呈波动降低的趋势，有多个产气高峰出现。各处理组均在试验开始的第1天均出现一个“产气高峰”，但结合甲烷含量(图4)可见，此时产生的气体中甲烷含量很低，可能主要由发酵体系中蛋白质、多糖等大分子有机物的微生物分解作用产生[16]；之后经不同时间，各处理组逐渐进入产生甲烷的主产气阶段，其中以新鲜马铃薯茎叶为原料的CK组在第6天出现高甲烷浓度的第2个产气高峰，产气量为1.37 L·d-1；而分别以青贮30 d，60 d，120 d，180 d马铃薯茎叶为原料的T1，T2，T3和T4组则均在第5天出现第2个产气高峰，产气量分别为1.54 L·d-1，1.68 L·d-1，1.79 L·d-1和1.83 L·d-1，比CK组提前1 d，产气启动更快；由于发酵原料成分组成的复杂性，各处理组此后均又出现多个产气高峰，但日产气量在波动中逐渐降低，至试验结束的40 d时沼气产生已趋于停止，各组日产气量变化趋势较为接近。

图2 厌氧发酵沼气日产量变化

2.5 原料青贮时间对累积产沼气量的影响

如图3所示，40 d的厌氧发酵试验周期内，CK及T1，T2，T3，T4试验组累积产沼气量分别为19.90 L和21.36 L，23.37 L，24.86 L，24.97 L。相对于新鲜马铃薯茎叶，以青贮30 d，60 d，120 d，180 d马铃薯茎叶为原料时，厌氧发酵累积产气量分别提高7.88%，18.03%，25.56%和26.11%，说明试验周期内，随马铃薯茎叶青贮时间延长，厌氧发酵累积产沼气量逐渐提高。

图3 厌氧发酵累积产沼气量

2.6 原料青贮时间对甲烷含量的影响

马铃薯茎叶青贮时间对厌氧发酵产气甲烷含量的影响如图4所示，40 d试验周期内各处理组甲烷含量均呈“升高-稳定-降低”的变化趋势。各处理组甲烷含量均在第6天时超过50%，T1，T2，T3和T4试验组厌氧发酵所能达到的最高甲烷浓度分别为58.36%，60.17%，60.32%和60.15%，均显著高于CK对照组(55.39%)；发酵末期，随着产气量的减少，CK对照组甲烷浓度在第36天低于50%，而T1，T2，T3和T4试验组甲烷浓度则均在第39天低于50%，说明对马铃薯茎叶进行青贮处理能够提高厌氧发酵产甲烷含量，提高沼气品质。同时可以发现，青贮时间从30 d延长到60 d时甲烷浓度有一定提高，而继续延长青贮时间至180 d则对甲烷浓度影响不大。

图4 厌氧发酵甲烷含量变化

3 讨论

马铃薯茎叶作为一种营养丰富、存量巨大的农业废弃物，近年来已成为沼气工程的重要原料来源，然而由于马铃薯收获的地域性、季节性因素，其产生相对“集中”，须通过一定方式进行长期保存才能满足沼气产业稳定发展的需要。青贮作为一种传统的饲草保藏方式，同样适用于作物秸秆、尾菜等的保质贮存，对于解决沼气产业发展中“原料不足”的瓶颈问题有很大帮助。然而青贮过程中，物料成分可能随时间推移发生各种变化，进而对产沼气特性也将产生不同影响，物料种类、青贮条件等因素差异可能导致完全相反的结论[4-6]。

为探明不同青贮时间对马铃薯茎叶厌氧发酵产沼气性能的影响，本研究首先对青贮30 d，60 d，120 d和180 d马铃薯茎叶成分与新鲜马铃薯茎叶进行了比较。青贮过程中，TS，VS均有一定降低，如180 d时TS，VS分别降低6.60%，6.85%，说明有机物质在青贮过程中有所损失，这部分损失可能来自WSC等易降解成分和NDF等难降解组分，180 d时WSC和NDF含量分别减少50.77%13.47%。WSC和NDF均是厌氧沼气发酵的重要能量来源，WSC可为发酵微生物直接利用，其减少不利于沼气产生，而NDF的适度分解则能够起到“预处理”的效果，提高产沼气性能，因此青贮过程中WSC和NDF减少对厌氧沼气发酵的影响需要综合考虑[17]。

“pH值迅速降低、乳酸大量产生及乙酸、氨氮/总氮比值控制在一定范围内”等是青贮成功的重要标志[18-19]。本研究0～180 d的试验周期内，pH值迅速降至4.18±0.03后始终维持在较低水平，乳酸含量始终在30 g·kg-1以上，乙酸含量和氨氮/总氮比值始终在10 g·kg-1和6%以下，说明青贮品质控制良好。丁酸主要由酪酸菌、霉菌等腐败微生物分解蛋白质、乳酸等产生，无论对于青贮本身，还是对于后续厌氧发酵都是有害因素，本青贮过程中丁酸含量始终为0，进一步说明青贮中0.2%丙酸的加入对促进酸化、杂菌控制起到了良好的效果。

以不同青贮时间的马铃薯茎叶应用于厌氧沼气发酵时，相对于新鲜茎叶原料，发酵前期沼液pH值降幅更大，说明挥发性脂肪酸产生量更高，体系酸化程度更深，也更加有利于甲烷微生物利用挥发性脂肪酸产生甲烷；此后各青贮原料组pH值能够恢复到更高的水平，也反映了以青贮马铃薯茎叶为发酵原料时，系统缓冲能力更强，有机酸消耗更快，更有利于沼气微生物菌群的生存。由图2可见，以不同青贮时间马铃薯茎叶为原料时，日产气曲线与新鲜马铃薯茎叶相似，均存在多个产气高峰，该现象可能是由物料中可溶性糖、半纤维素、纤维素等不同组分逐次降解、有机酸波段产生等因素造成，青贮能够起到“预处理”的效果，降低物料复杂程度，可在一定程度上加速发酵的启动，与付广青等的研究结果接近[20]。

累积产气量、甲烷含量是衡量物料厌氧发酵产沼气性能的关键指标。如图3和图4所示，以青贮30 d，60 d，120 d，180 d马铃薯茎叶为发酵原料时，累积产气量分别比新鲜马铃薯茎叶组提高7.88%，18.03%，25.56%和26.11%，最高甲烷含量分别提高5.36%，8.63%，8.90%和8.59%，说明在固定各实验组发酵原料TS比例的前提下，180 d内随马铃薯茎叶青贮时间延长，厌氧发酵累积产气量逐渐提高，同时最高甲烷含量比新鲜马铃薯茎叶对照组有显著提高，即适当延长青贮时间可提高单位TS青贮物料的累积产气量和甲烷含量。

4 结论

试验结果表明，添加0.2%丙酸的条件下对马铃薯茎叶进行青贮操作，180 d内能较好的保存其有机物质，确保厌氧沼气发酵潜力：

(1)青贮过程中，马铃薯茎叶CP，EE在减少后有一定升高，而TS，VS，WSC，NDF等均有所降低，主要有机成分随青贮时间损失逐渐增加；30～180 d青贮周期内，pH值下降后逐渐稳定在4.10～4.40区间，乳酸、丙酸含量虽有下降但仍维持在30 g·kg-1和5 g·kg-1水平以上，乙酸含量、氨氮/总氮比值虽逐渐上升但仍然较低，丁酸含量始终为0，青贮品质良好。

(2)厌氧发酵过程中，各处理组pH值均呈“下降-升高-稳定”的变化趋势，其中以青贮马铃薯茎叶为原料的各试验组最低pH值分别为5.66，5.45，5.73，5.70，均显著低于新鲜马铃薯茎叶对照组(5.91)，而发酵后期各试验组pH值则显著高于对照组，说明发酵前期青贮原料酸化更迅速，发酵后期体系酸碱更平衡。

(3)厌氧发酵过程中，各处理组均出现多个“产气高峰”，原料青贮可提高最高日产气量，缩短产甲烷启动时间；以青贮30 d，60 d，120 d，180 d马铃薯茎叶为原料时，相比新鲜马铃薯茎叶，累积产气量可分别提高7.88%，18.03%，25.56%和26.11%；同时，青贮可显著提高马铃薯茎叶厌氧发酵所产沼气的甲烷含量。

利用马铃薯茎叶等农业有机废弃物进行厌氧沼气发酵，对解决农村地区能源短缺和环境污染问题具有双重意义。本研究尝试利用青贮手段保存马铃薯茎叶的有机物质，一定程度上提高了其厌氧发酵性能，可有效缓解新鲜马铃薯茎叶不易保存和沼气工程原料缺乏的突出矛盾，对其它产量巨大、季节性明显的蔬菜废弃物、作物秸秆等生物质资源的沼气化利用有一定借鉴意义。同时，应该注意到青贮过程受青贮时间、物料种类、添加剂类型等因素影响较大，仍需要根据不同类型的生物质资源分别开展针对性研究。