石斛多糖抑制自发性高血压大鼠晚期糖基化终产物受体mRNA的有效剂量观察*

赖腾芳, 李近都, 邹才华, 曾德创, 梁烨, 陆克兴, 潘兴寿, 李天资△

右江民族医学院附属医院 1心血管内科，3腺体外科，4心胸外科, 5临床教学部(广西百色 533000)； 2广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科(广西南宁 530021)

葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类的基团与蛋白质、脂质或核酸等分子末端的胺基发生缩合反应生成稳定的共价加成物早期糖基化产物，后者再经脱水、氧化及化学重排等反应变成晚期糖基化终产物(advanced glycation end-product，AGE)，机体内过多的AGEs在沉积，通过晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end-product，RAGE)和非受体途径参与动脉粥样硬化(AS)等的慢性血管退化性疾病的发生发展过程，备受关注[1]。石斛(dendrobium)有抑制炎症反应，增强免疫力等功效，在抑制动脉粥样硬化的炎症反应中挥了积极的作用，但其作用的靶点及其机制还不完全清楚[2]。循证医学(EBM)是运用实验观察信息，选取准确的有效剂量给患者治疗[3]。为了解石斛多糖药物对AGE和RAGE mRNA水平影响的最低有效剂量。本研究于2017年1月至2018年5月观察不同剂量石斛多糖治疗自发性高血压大鼠(SHR)，于治疗前后观察其AGE和腹肌RAGE mRNA表达水平，并与对照组比较。

1 材料与方法

1.1 石斛多糖 采用广西根辽生物技术有限公司的移栽铁皮石斛组培苗种植，采集：月龄为 (26±0.5)月的鲜品石斛全株，经本院陆高翔副主任药师鉴定为铁皮石斛(dendrobium officinale)。称取铁皮石斛茎(100.0±1.0) g，加入(300±1.0) mL水，浸泡(6±0.1) h，再加入(200±1.0)mL水，采用热水回流加纤维素酶(Cellulase)浸提法提取，将滤液水浴加热浓缩至含生药量为1 g/mL的石斛多糖药饮(以下简称石斛)药液，杀菌，贮存于4 ℃冰箱内备用，使用时用常温白开水稀释至所需浓度。

1.2 动物与饲料 (1)SHR均由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(粤)2013-0034。(2)鼠饲料丸由上海新奇特种饲料厂提供。选取雄性SHR 36只，均为2月龄，体重(213±5)g，普通级。(3)喂养方法：架式笼养，每组1笼，室温(20±2)℃，相对湿度(75±5)%，光照明暗各12h交替。6组均等量喂鼠饲料丸，饮用水自由饮用。连续2个月。

1.3 动物分组和给药方法 (1)随机分为6组，每组6只，分别为对照组和5组石斛治疗组。(2)给药方法：对照组每只SHR口腔给予常温白开水1.0 mL/d，治疗1组每只鼠口腔给予石斛0.10 g/d(0.10 g组)；治疗2组每只鼠口腔给予石斛0.12 g/d(0.12 g组)；治疗3组每只鼠口腔给予石斛0.14 g/d(0.14 g组)；治疗4组每只鼠口腔给予石斛0.20 g/d(0.20 g组)；治疗5组每只鼠口腔给予石斛0.4g/d(0.40 g组)。1次/d。

1.4 观察方法 实验过程中观察大鼠的一般情况，于干预前后分别测量血压，并行标本采集。

1.4.1 标本采集 于实验前后分别麻醉大鼠进行标本采集。(1)麻醉方法：碘伏消毒，以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。(2)血液标本采集：剃去腹部的毛，解剖，切腹壁打开腹腔，从腹主动脉取血0.5 mL，低温分离取血浆。(3)腹肌标本采集：剪取腹直肌15 mm×3 mm组织，剪成5 mm×3 mm共3小块，分别置于3个冻存管，于30 min内液氮固定4 h，移至-70℃冰箱保存备检。

1.4.2 ELISA检测 检测AGE ELISA试剂盒由杭州沃森生物技术有限公司提供，用美国BIO RAD 550 型酶标仪检测，严格按检测方法和程序进行。

1.4.3 RAGE mRNA水平检测 用RT-PCR 法，取100 μL 腹肌匀浆，用Trizol 试剂提取总RNA，氯仿和异丙醇抽提。紫外分光光度仪和琼脂糖电泳鉴定RNA的浓度和纯度，取10 μL 根据逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA，-70℃冻存备用。取5 μL 逆转录产物进行PCR扩增反应，并以β-actin 为内参对照。根据GeneBank人RAGE基因(GeneBank登录号AB036432)设计RAGE 基因引物，由杭州联川生物技术有限公司设计合成。RAGE基因及其管家基因序列及扩增长度，见表1。PCR反应条件: 55℃逆转录反应60 min，94℃变性2 min→94℃30 s→55℃30 s→72℃1 min，共30循环，72℃延伸7 min。胶回收试剂盒回收目的基因片段。PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像仪采集图像，PCR仪获得产物Ct 值，采用2-ΔΔCt相对定量计算公式计算分析。

表1 RAGE基因及其管家基因扩增的引物序列

2 结果

2.1 不同剂量石斛多糖对SHR AGE的变化比较 治疗前6组AGE平均水平差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后0.10 g组AGE平均水平与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)，与对照组比较差异也无统计学意义(P>0.05)；0.12 g组、0.14 g组、0.20 g组和0.40 g组AGE平均水平低于对照组(P<0.01，P<0.05)，也低于组内治疗前的水平(P<0.01，P<0.05)。见表2。

组别n治疗前治疗后P值对照组66.71±1.496.42±1.42>0.050.10g组66.67±1.434.85±1.39>0.050.12g组66.60±1.473.45±1.13∗∗<0.010.14g组66.66±1.454.29±1.33∗<0.050.20g组66.70±1.374.28±1.36∗<0.050.40g组66.68±1.564.31±1.41∗<0.05

注：与对照组治疗后比较 *P<0.05，**P<0.01

2.2 不同剂量石斛多糖对SHR RAGE mRNA的变化比较 治疗前6组RAGE mRNA平均水平差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后0.10 g组RAGE mRNA平均水平与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)，与对照组比较差异也无统计学意义(P>0.05)；0.12 g组、0.14 g组、0.20 g组和0.40 g组RAGE mRNA平均水平低于对照组(P<0.01)，也低于组内治疗前的水平(P<0.01)。见表3、图1。

组别n治疗前治疗后P值对照组60.98±0.140.95±0.16>0.050.10g组60.89±0.130.69±0.21>0.050.12g组60.90±0.180.37±0.12∗<0.010.14g组60.95±0.110.40±0.15∗<0.010.20g组60.94±0.120.41±0.14∗<0.010.40g组60.99±0.150.42±0.14∗<0.01

注：*与对照组治疗后比较P<0.01

3 讨论

AGE在非酶促条件下，蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生的一组对机体有害的物质，与动脉粥样硬化损伤的发生和发展相关联，备受关注[4]。

注：1：对照组；2：0.10 g组；3：0.12 g组；4： 0.14 g组；5：0.20 g组；6：0.40 g组

图1石斛多糖对腹肌RAGEmRNA表达的影响

人类RAGE编码基因位于6号染色体上，包含11个外显子和10个较短的内含子[5]。RAGE是一类模式识别受体，正常情况下RAGE表达量很低，当机体出现氧化应激时，活性氧簇产生增多，AGE聚集，RAGE表达量上调，激活如磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)、分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)、应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK)、信号传导及转录激活因子 (signal transducers and activators of transcription, STAT)等多种信号传导通路的级联放大反应，并激活下游核转录因子(NK-κB)等，调节多种基因的转录表达，多量的炎症因子释放，导致血管通透性增高，血管收缩，单核细胞黏附，基质成分增多等损伤，在动脉粥样硬化损伤的发生发展中发生作用[6-10]。阻断应激反应所致的RAGE表达量上调，被作为防治动脉粥样硬化及其并发症的方向标[11]。

石斛药用历史悠久，药用成分丰富，剂型多样，临床应用广泛，用于治疗眼科疾病，肠胃疾病、血栓闭塞性疾病、高血压、糖尿病、动脉粥样硬化、中毒和癌症等病症的治疗，取得很好的效果，深受患者喜爱。目前普遍认为，石斛有抗炎，抗氧化，提高免疫力等功效，与其活血化瘀，行气通络，豁痰利气的作用有关[12-18]。陆高翔等[12]实验研究认为，石斛可以改善实验大鼠慢性萎缩性胃炎(CAG)的胃黏膜血流量,提高其PGE2含量，提示其对CAG大鼠的胃黏膜有提高其屏障功能和御炎作用，对CAG有防治作用。唐汉庆等[13]实验研究认为，铁皮石斛具有改善心肌功能，抑制血管病理进展、减轻血管损害的作用。黄元东等[15]临床观察提示，铁皮石斛可提高患者的耐中毒能力，有效改善患者的胆碱能代谢紊乱，抑制炎症反应，减轻患者的临床症状,减少并发症的发生，促进患者康复，对急性有机磷农药中毒患者有辅助治疗作用。动脉粥样硬化是以动脉硬化为临床表现一种的慢性血管性疾病，其特点是受累动脉病变从内膜开始。一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，病变常累及弹性及大中等肌性动脉，阻塞动脉腔，造成组织或器官将缺血或坏死[19]。

最近研究认为，动脉粥样硬化与RAGE基因功能紊乱有关[20]，中医认为动脉粥样硬化性疾病本为阴阳失调，标为内生之风、痰浊和瘀血。治疗上应当用活血化瘀，行气通络，豁痰利气等[21]。本研究结果显示，与对照组比较，治疗后0.12 g组、0.14 g组、0.20 g组和0.40 g组的AGE和RAGE mRNA平均水平低于对照组(P<0.01)，也低于组内治疗前的水平(P<0.01)。提示石斛多糖可以降低AGE生成和积累，抑制RAGE活化，对SHR靶器官损害起到保护性作用。

本研究结果提示，石斛多糖能有效降低SHR体内AGEs水平，降低RAGE基因的活化，对缓解SHR的血管重塑有积极的作用。不同剂量治疗组AGE和RAGE mRNA平均水平有剂量效应关系，用石斛多糖0.12 g/d才能有效控制SHR的AGE和RAGE mRNA过高的水平。