免疫球蛋白基因重排在滤泡性淋巴瘤中的应用

许 洁，崔 倩，张科平，陈 洁，林丹义，徐方平，朱小兰，骆新兰

滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma, FL)起源于滤泡生发中心B细胞一类非霍奇金淋巴瘤，由于其症状不明显，就诊时，多数已为Ⅱ～Ⅲ期，因此早期诊断十分重要[1]。FL与淋巴滤泡反应性增生的鉴别诊断，绝大多数病例依据组织学特征并结合临床表现便可以做出明确诊断，也有不少疑难病例借助免疫组化、分子遗传等技术进行鉴别和确诊，基因重排分析确定B细胞增生的克隆性，有助于解决这一问题[2]。本文应用PCR-GeneScan法检测39例FL免疫球蛋白重链/轻链(IgH/L)基因重排，统计分析克隆性IgH/L基因重排与肿瘤分级的关系，探讨其对于滤泡性淋巴瘤早期诊断的作用。

1 材料与方法

1.1 标本收集2016年9月～2019年2月广东省人民医院病理科诊断的39例FL石蜡标本，均为手术标本，平均年龄(54.64±17.47)岁，根据WHO(2008)淋巴造血系统肿瘤分级标准[3]，其中15例为FL1，7例为FL2，17例为FL3(11例为FL3A，6例为FL3B)。

1.2 主要仪器与试剂基因重排检测试剂盒(IgH3+IgK,PCR毛细管电泳法，CL220001),基因重排检测试剂盒(HE，PCR毛细管电泳法，CL220004)，基因重排检测试剂盒(IgL，PCR毛细管电泳法，CL220006)由上海源奇生物公司提供，引物序列均来源于BIOMEN-2的研究成果[4]；QIAamp石蜡标本DNA提取试剂盒(56404)购于德国Qiagen公司；去离子甲酰胺HIDI(ABI公司)；分子内标GS500Liz(ABI公司)；POP7胶(ABI公司)；基因扩增PCR仪(美国ABI Veriti)；基因测序仪(美国ABI3500DX)；Nanodrop 2000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 基因组DNA提取切取10 μm厚组织4片，切片贴于干净的玻片上。二甲苯脱蜡至水后，按照HE染色片所选取的肿瘤区域小心用无菌刀片将肿瘤组织刮入1.5 mL的EP管中。应用QIAamp石蜡组织DNA抽提试剂盒提取DNA。DNA利用Nanodrop 2000超微量分光光度计检测其浓度及吸光度(A)值，经0.8%琼脂糖电泳判定其质量。

1.4 PCR+基因扫描法(1)PCR反应体系采用基因重排检测试剂盒(上海源奇生物公司)包括：模板DNA至少100 ng；PCR预混反应液包括IgH管A、B、C，IgK管A、B，IgL，对照基因管(引物序列参照BIOMED-2研究结果[4])；Ampli Taq Gold DNA聚合酶。各反应体系配制：PCR反应液16 μL+ Ampli Taq Gold DNA聚合酶1 μL+DNA(包括待检样本，相应的阳性对照、空白对照)3 μL。反应条件：95 ℃ 7 min，95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s,合计40个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。(2)基因扫描试剂配制：PCR扩增产物1 μL+LIZ500 0.5 μL+HIDI 10 μL，变性条件：95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，将上述变性产物在基因测序仪上进行毛细管电泳。(3)结果判读：对照基因管若在100、200、300、395 bp收集到ROX荧光信号，表示DNA的质量符合实验要求，相应的阳性对照在有效的范围内收集到不连续的荧光信号，而空白对照未收集除引物峰以外的荧光信号，如实验满足以上有效条件，在有效范围内的1个或2个强阳性条带的样本提示基因重排为阳性，反之为阴性。

1.5 统计学分析所有数据应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，采用χ2检验和Spearman等级相关检验。

2 结果

39例FL中有29例(29/39，74.36%)IgH/L基因重排阳性，其中，FL1基因重排的检出比例为8/15，FL2重排的检出比例为5/7，FL3重排的检出比例为16/17，仅1例FL3B未检出克隆性重排。Spearman等级相关检验和χ2检验结果显示，IgH/L基因重排在FL3中的检测率高于FL1、FL2，其检出率与FL的分级呈显著正相关(rp=0.376,P<0.001)，FL1、FL2和FL3中表达差异有显著性(P=0.004)，FL3A(11/11)与FL3B(5/6)检出率差异无统计学意义(P=0.209)；15例IgH基因重排阳性(15/39，38.46%)，联合IgK，检出率提升至74.36%(29/39)，差异有统计学意义(P=0.003)。

3 讨论

FL是最常见的惰性淋巴瘤，根据WHO(2008)淋巴造血系统肿瘤分级标准，FL可分为3级，其中FL1和FL2属于低级别淋巴瘤，FL3属于高级别淋巴瘤，FL3可进一步分为3A和3B[3]。FL3尤其是FL3B常伴弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma)区域[5]。非霍奇金淋巴瘤是一种原发于淋巴结及其他淋巴组织的恶性肿瘤，克隆性重排是克隆性增生和谱系来源的标志，已被公认为淋巴瘤诊断、鉴别诊断和治疗后监测的重要指标[6]；本组39例FL中，29例(29/39，74.36%)IgH/L基因重排阳性，检出率与国内报道相近[7-9]，其中FL1基因重排的检出比例为8/15，FL2重排的检出比例为5/7，而FL3重排的检出比例为16/17，仅1例FL3B未检出克隆性重排，FL1、FL2和FL3中克隆性重排的检出率差异有统计学意义(P<0.05)，FL3A与FL3B检出率差异无统计学意义(P>0.05)；本实验结果显示，IgH/L基因重排在FL3中的检测率高于FL1、FL2，其检出比例与FL的分级呈正相关。80%～90%的FL中发现t(14;15)(q32;q21)染色体易位，其在FL形成和形成早期是一个关键性的分子改变，在FL1～2级中约占85%，而FL3级尤其是FL3B级中t(14;15)易位少见，仅占15%～30%，形成这种差异可能与FL3B级中无残留的滤泡中心细胞有关[10]。本组实验结果显示，PCR-GeneScan检测IgH/L基因重排在FL3的检出率高，有效地弥补了单纯FISH法检测t(14;15)(q32;q21)染色体易位的缺陷。对于FL，由于发生体细胞超突变，导致VH基因片段的缺失，使IgH基因扩增出现假阴性而检出率降低，IgK重排很少受体细胞超突变的影响，因此联合IgK重排的检测可大大提高诊断的检出率[11-12]，本组39例FL中，15例(15/39，38.46%)IgH基因重排阳性，联合IgK检出率提升至74.36%(29/39)，差异有统计学意义(P<0.05)。IgH、IgL基因重排被认为可作为B细胞非霍奇金淋巴瘤的辅助诊断方法，近年开展的PCR法基因重排检测技术，克服了传统技术存在操作繁杂、耗时长等缺点，广泛被应用；分析技术目前临床上主要为凝胶电泳异源双链分析和基因扫描分析。基因扫描可以产生清晰的峰图，可以探测到0.5%～1.0%的克隆性淋巴细胞，即使有一个碱基的差别，基因扫描后通过图像峰的位置、高度、大小展示，是一种十分灵敏和精确的检验手段，有着广泛的应用空间[13]。本实验使用PCR-GeneScan检测IgH/L基因重排，利用Ig基因重排检测对滤泡性淋巴瘤的诊断有辅助性作用，并且利用PCR-GeneScan法可提高重排检测的敏感性和特异性，对于滤泡性淋巴瘤的早期诊断有一定的价值，值得推广。