成骨细胞源性外泌体的分离提取和鉴定

蔡则成，杨绍兵，马 荣，张彦龙，梁思敏

脊柱结核是由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病，以进行性骨质破坏为主要病理特征[1]，破骨细胞在脊柱结核骨质破坏的发生发展中起着极其重要的作用。正常情况下，成骨细胞形成新骨，破骨细胞吸收旧骨，二者相辅相成，保持着骨骼的健康生长[2]。近年来，外泌体的研究受到国内外学者的广泛关注，作为细胞间通讯的主要媒介，通过信息传递，调节靶细胞的生物学行为。成骨细胞与破骨细胞之间的交互作用，是否也通过外泌体来完成，目前报道不多。本研究旨在体外培养成骨细胞，分离提取成骨细胞源性外泌体，并对其表征与表达蛋白进行鉴定，进而为后期成骨细胞与破骨细胞的相互作用的研究提供前期基础，为脊柱结核的基础研究提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料：胎牛血清、DMEM培养基(以色列Biological Industries公司)，青-链霉素、胰蛋白酶(美国Invitrogen公司)，成骨细胞(K7M2-wt，中科院细胞库)，CD9抗体、AKP抗体(英国Abcam公司)，亚超速低温离心机(美国BeckmanAJ-30I)，透射电子显微镜(日本Hitachi H-9500)等。

1.2 实验方法

1.2.1 成骨细胞的体外培养及收集：成骨细胞(K7M2-wt)在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-链霉素、90% DMEM中的培养基中进行培养，并置于5%CO2、37 ℃培养箱中进行增殖。

1.2.2 差速离心法收集成骨细胞源性外泌体：①配制无外泌体培养基。将胎牛血清进行离心15 min(100 000 g、4 ℃)，去除血清中的外泌体，然后按10%胎牛血清、100 U/mL青-链霉素及DMEM的比例配制完成。②将成骨细胞分别接种至10 cm培养皿中(7×106/皿，3皿)，在培养24 h后，待细胞贴壁后将培养基更换为无外泌体培养基，继续培养至48 h后收集上清液，用过滤器(孔径0.22 μm)进行过滤后，采用亚超速低温离心机离心10 min(4 ℃，300 g)后取上清液；继续离心10 min(4 ℃，2 000 g)，取上清液；继续离心30 min(4 ℃，100 00 g)，取上清液；继续离心90 min(4 ℃，140 000 g)，弃上清液，所得沉淀即为外泌体。③用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140 000 g再次离心90 min，再次用100 μl PBS缓冲液重悬沉淀，于-80 ℃低温保存，备用。

1.2.3 外泌体的鉴定：①透射电子显微镜观察(TEM)形态。在室温条件下，在铜网上轻轻滴入外泌体悬液10 μl，吸附1 min，并干燥1 min后，用滤纸从侧面吸干多余的液体，用醋酸双氧铀室温染色1 min，吸干染液并自然干燥12 h 后在TEM下观察外泌体的形态。②WB检测外泌体标志蛋白。取20 μl 外泌体，加入3.5 μl 6XSDS-PAGE上样缓冲液，沸水变性5 min，立即冰上孵育静置；然后进行12% SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，封闭1 h；一抗4 ℃过夜孵育(稀释度：CD9为1∶2 000，AKP为1∶2 500)，PBST洗涤3次，每次5 min；二抗孵育2 h，PBST洗涤3次，每次5 min，最后显色成像。

2 结果

2.1 成骨细胞的培养：显微镜下观察，成骨细胞培养24 h后可贴壁,细胞呈梭形、三角形或不规则圆形,呈铺路石状，并且有集落样生长趋势,集落中心细胞排列紧密，细胞核居中或偏于细胞一侧，见图1(目录后)。

2.2 成骨细胞源性外泌体的鉴定：透射电镜下，以差速离心法提取成骨细胞源性外泌体为圆形或接近圆形，直径在30～100 nm，与文献[3]报道的外泌体形态、大小基本一致。通过WB检测其跨膜蛋白CD9和来源细胞的特异性蛋白AKP表达阳性，见图2(目录后)。

3 讨论

脊柱结核是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性感染性疾病，是最常见的骨关节结核，主要的病理特征为进行性的椎骨破坏，从而导致脊柱失稳、畸形，甚至并发截瘫，严重影响着患者的生活质量，社会危害性大[1]。这种病理变化与破骨细胞的异常增殖和活化有着密切关系，但确切机制目前并未研究清楚，可能与免疫调节、炎症介质、细胞因子或细胞通讯等的作用有关[4]。在骨微环境中成骨细胞与破骨细胞的作用是相辅相成的，脊柱结核破骨细胞的异常增殖是否与成骨细胞有关，目前亦无统一结论。

外泌体是细胞内部的囊泡结构，几乎所有细胞均可分泌，具有脂质双层膜，是一类粒径为30～120 nm，有典型的“茶托”形态，含有来源细胞的部分蛋白质、核酸及降解片段等成分，作为细胞间通讯的主要介质，可以将这些内部信息传递给靶细胞，调控靶细胞的生物学行为[5]。基于外泌体的理论知识，我们设想破骨细胞的形成是否与成骨细胞的调控有关，成骨细胞是否通过外泌体途径诱导破骨细胞形成。为了验证此假设，我们前期进行了成骨细胞源性外泌体的提取分离和鉴定。

由于外泌体的体积、密度较小，将其与细胞中的其它成分进行分离的难度大，而且不同的分离方法得到的外泌体理化性质亦不相同，目前差速离心法是分离外泌体的“金标准”，也是实验中最广泛的方法[6]。差速离心法的基本原理是：因外泌体的在细胞培养液中的重量非常小，离心的过程中，重量大的非外泌体物质较早地沉淀在底部，而外泌体需要更大的离心力才能沉淀，并且脂蛋白、蛋白质等物质聚集在一起可以共同沉淀[7]。故本研究采用最经典的差速离心法来提取、分离成骨细胞释放的外泌体，研究证实此方法可行。文献报道，在观察外泌体的大小与形态时，多推荐采用透射电子显微镜(TEM)，它是将经过加速和聚集的电子束投射在样品上，从而出现立体角散射。目前TEM的分辨率可达到0.2 nm，远远小于外泌体的粒径，并且有研究发现在TEM下，差速离心法获得的外泌体直径多在30～100 nm，形态与大小均一，但是试剂盒获得外泌体却无法达到良好的观测结果[8]。本研究采用所提取的成骨细胞来源的外泌体，在TEM下呈“茶托样”外观，直径在30～100 nm，符合外泌体的一般特性，与文献报道一致[3]。

通常来说，外泌体的蛋白质组成与其来源细胞有着密切的关系，虽然来源的细胞种类非常多，但是不同的细胞所分泌的外泌体可以表达部分相同的蛋白质，如膜转运融合蛋白(annexins、RAN、GTpases)、跨膜蛋白(CD63、CD81、CD9)、热休克蛋白(Hsp70、Hsp90)等。此外，还可以表达与来源细胞相同的特异性蛋白，如A33(结肠上皮细胞来源)、MHC-Ⅱ(抗原提呈细胞来源)等[9]。本研究通过WB的方法测试成骨细胞源性外泌体表达跨膜蛋白CD9与来源细胞的特异性蛋白AKP的表达情况，结果证明成骨细胞源性外泌体高表达跨膜蛋白CD9和来源细胞的特异性蛋白AKP，与外泌体的基本特征一致[10]。

综上所述，采用差速离心法成功获取了成骨细胞来源外泌体，其外观、大小及跨膜蛋白的表达具有外泌体的一般特性，并高表达成骨细胞特异性蛋白AKP，为后期成骨细胞与破骨细胞相互作用的研究提供了前期基础。