红肉蜜柚果实冷藏过程中的活性氧代谢

汪永红，罗晓敏，刘顺枝，胡位荣

(广州大学 生命科学学院，广东 广州，510006)

1 材料与方法

1.1 材料

成熟红肉蜜柚果实，广东省梅州市商业性生产柚园。

1.2 仪器与设备

5810 R冷冻高速离心机,德国Eppendorf公司；UV-1800PC型紫外分光光度计,上海美谱达仪器有限公司；RXZ-430D型智能人工气候培养箱，宁波东南仪器有限公司；SZ-93型自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；DW-86L388J型Haier医用超低温保存箱，青岛海尔特种电器有限公司；WP-RO-208型沃特浦实验室超纯水机，四川沃特尔水处理设备有限公司；301P-01N型台式pH计，美国Thermo orion公司。

1.3 方法

挑选大小一致、无病虫害、无机械损伤的果实，立即运回实验室，用施保功(咪鲜胺锰盐，美国富美实公司)∶水(1∶1 500，质量比)溶液浸泡1 min灭菌，取出晾干，放置室温预贮48 h，用保鲜膜包装封口，随机分成2组，分别置于人工气候培养箱中，贮藏条件分别为室温对照(25 ℃)和冷藏(8 ℃)[6-7]，相对湿度为80%～90%。果实贮藏90 d，每隔10 d分别取3个果实，分离外果皮、白皮层和汁胞3个部分，于赤道附近随机混合取样各1 g，将样品置于-80 ℃超低温冰箱中速冻备用。

1.3.1 MDA含量测定

参照JANNATIZADEH等[8]的方法并略加改进。取1 g样品，加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)，手动匀浆，于4 ℃下10 000 r/min离心15 min。取1 mL上清液，加入3 mL 0.5% 硫代巴比妥酸(TBA)，反应30 min后，10 000 r/min离心15 min，取上清液分别测定532和600 nm的吸光值，重复3次取平均值，结果以μmol/g(FW)表示。

1.3.2 H2O2含量测定

参照SUN等[9]的方法，略有修改。取1 g样品，加入预冷丙酮，匀浆，于4 ℃12 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL加入四氯化钛-盐酸溶液0.5 mL、浓氨水0.2 mL充分混合、反应10 min，收集沉淀，向沉淀中加入3 mL稀硫酸，待其完全溶解后，测定410 nm处反应液吸光值，重复3次取平均值，结果以mmol/g(FW)表示。

1.3.3 CAT、POD和SOD活性的测定

参照李玲[10]的方法。CAT活性的测定，在240 nm处测定吸光值，以每分钟减少0.01为1个酶活力单位(U)，结果以U/g(FW)表示；POD活性的测定，2 mL 0.1% H2O2，0.95 mL 0.2%愈创木酚，50 μL粗酶液，迅速比色，以每分钟变化0.01为1个酶活力单位(U)，结果以U/g(FW)表示；SOD活性的测定，在4 000 lx的光强下反应20 min，分别测定560 nm处各反应液的吸光值，以抑制氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化还原的50%为1个酶活力单位(U)，结果以U/g(FW)表示。以上指标重复3次测定取平均值。

1.4 数据统计

使用SPSS Statistics 21和Excel 2010绘制图表，用Duncan 多重比较法分析差异显著性，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 冷藏对果实MDA含量的影响

MDA是活性氧对细胞膜脂过氧化的产物，是评价膜结构损伤程度的指标之一[11-13]。冷藏条件下果实的汁胞MDA含量变化相对稳定，前50 d汁胞中的MDA含量均低于对照组(图1-A), 50 d时差异达到显著水平(P<0.05)，冷藏减轻汁胞膜脂过氧化程度，维持汁胞细胞膜结构的完整；白皮层的MDA含量在贮藏过程中整体呈下降的趋势(图1-B)，冷藏条件下70 d时MDA含量显著(P<0.05)高于对照组，可能是因为蛋白质、核苷酸和糖类等多种非脂类生物分子降解也可产生MDA[14]；冷藏条件下的外果皮MDA含量始终高于对照组(图1-C)，原因是冷藏条件下外果皮的细胞膜结构损伤大于对照组。可见，果实不同部位的膜脂过氧化程度不同，其中膜脂过氧化伤害最严重的部位是汁胞，白皮层次之，外果皮最轻，冷藏减少了汁胞中MDA的积累，能延缓红肉蜜柚汁胞衰老进程。

图1 红肉蜜柚贮藏过程中汁胞(A)、白皮层(B)、外果皮(C)的MDA含量变化Fig.1 Changes of MDA content in juice sacs (A), white cortex (B) and peel (C) of Red-fleshed sweet pomelo during storage注：不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)(下同)

2.2 冷藏对果实H2O2含量的影响

H2O2是活性氧表现形式的一种，因为它具有较高的氧化还原活性，过度积累能引起细胞内含巯基的多种酶和蛋白失活，最终会影响果实的生理调控和代谢。冷藏10 d时的汁胞、白皮层和外果皮的H2O2含量均显著高于(P<0.05)对照组，可能是因为在正常细胞当中，适量活性氧含量的增加，可提高果实对低温的应激性[15-16]。在整个贮藏过程中，冷藏30 d后的汁胞(图2-A)H2O2含量低于对照组，冷藏能减少果实汁胞和白皮层H2O2的积累；果实外果皮冷藏50 d时H2O2含量显著(P<0.05)高于对照组，受果实H2O2清除系统影响下降至80 d后上升(图2-C)，对照组贮藏30 d时达到峰值后波动下降至70 d后上升，冷藏能在贮藏前80 d降低果实外果皮H2O2的积累，保持外果皮正常的生理代谢。

图2 红肉蜜柚贮藏过程中汁胞(A)、白皮层(B)、外果皮(C)的H2O2活性的变化Fig.2 Changes of H2O2 content of juice sacs (A), white cortex (B) and peel (C) of red-fleshed sweet pomelo during storage

2.3 冷藏对果实CAT活性的影响

CAT主要存在于过氧化物酶体和乙醛酸循环系统中，可以催化H2O2生成H2O和O2，从而保护膜不受伤害[17-18]，由图3可知，在果实贮藏前期，CAT活性呈现下降趋势。随着贮藏时间的延长，果实缓慢衰老，50 d后2组CAT活性变化趋势相同，50 d时酶活性上升，70 d达到最大值后下降，50～70 d冷藏汁胞的酶活性显著高于对照组(图3-A)；60 d后冷藏白皮层CAT活性高于对照组，50 d后外果皮CAT活性高于对照组。表明冷藏能维持果实CAT较高的生理活性，延缓果实衰老进程，延长果实贮藏保鲜期；红肉蜜柚不同部位的CAT活性为汁胞<白皮层<外果皮。

2.4 冷藏对果实POD活性的影响

POD可催化低浓度的H2O2氧化酚类，贮藏前期与CAT相互协调清除植物体内的H2O2，贮藏后期参与果实的衰老[19-20]。冷藏果实汁胞POD活性变化相比对照组较为稳定，50 d时显著低于(P<0.05)对照组(图4-A)；冷藏白皮层的POD活性在60 d后有上升趋势，较对照组有明显增强(P<0.05)。外果皮的POD活性(图4-C)分别是汁胞和白皮层的120、30倍。酶活性的增强可维持外果皮的正常生理状态，使柚果在衰老过程中汁胞粒化而外果皮无明显变化，这与张世怡等[21]研究结果相一致。结果表明，低温能维持较高的POD活力，果实不同部位的POD活性为：汁胞<白皮层<外果皮。

图3 红肉蜜柚贮藏过程中汁胞(A)、白皮层(B)、外果皮(C)的CAT活性变化Fig.3 Changes of CAT activity of juice sacs (A), white cortex (B) and peel (C) of red-fleshed sweet pomelo during storage

图4 红肉蜜柚贮藏过程中汁胞(A)、白皮层(B)、外果皮(C)的POD活性变化Fig.4 Changes of POD activity of juice sacs (A), white cortex (B) and peel (C) of red-fleshed sweet pomelo during storage

2.5 冷藏对果实SOD活性的影响

由图5-A可知，冷藏果实汁胞的SOD活性在前20 d缓慢下降，30 d后上升后显著(P<0.05)高于对照组；白皮层SOD活性呈现波动上升趋势(图5-B)，贮藏40 d时，冷藏果实白皮层SOD活性低于对照组1倍。果实贮藏80 d时，冷藏白皮层SOD活性显著(P<0.05)高于对照组，冷藏能维持贮藏后期白皮层SOD的活性；对照组外果皮的SOD活性40 d达到最大值，冷藏60 d达到最大值，表明冷藏更有利于维持果实内活性氧的平衡，延长果实的保鲜贮藏期。果实不同部位的SOD活性与POD、CAT相似。

图5 红肉蜜柚贮藏过程中汁胞(A)、白皮层(B)、外果皮(C)的SOD活性变化Fig.5 Changes of SOD activity of juice sacs (A), white cortex (B) and peel(C) of red-fleshed sweet pomelo during storage

3 讨论

果实采后衰老是一个复杂的生理过程。活性氧清除系统主要包括非酶促和酶促两大类，酶促系统主要包括CAT、POD、SOD等多种酶。以果实内MDA和H2O2的含量，以及活性氧代谢相关酶的酶活性高低揭示果实在衰老过程中的活性氧变化[22-24]。冷藏红肉蜜柚汁胞MDA含量显著(P<0.05)低于对照组，汁胞膜脂过氧化程度较低，细胞膜较为完整，能阻断汁胞内营养物质转移；冷藏果实白皮层与对照组相比，贮藏前期MDA含量持续下降，H2O2含量80 d出现峰值, CAT、POD和SOD随之在80 d时出现活性高峰，对照组白皮层H2O2含量在80 d出现含量峰值，但是无酶活性高峰出现，表明冷藏果实白皮层在贮藏80 d后仍具有良好清除H2O2的能力，而对照组白皮层在80 d时，清除H2O2能力下降，则低温能保持白皮层相关酶的活性，延缓果实白皮层的衰老进程。外果皮的酶活性最强，酶活性的增强能有效地减少外果皮H2O2的积累，减少MDA的产生，降低H2O2对细胞膜结构和功能的损害程度，低温能延缓果实的衰老与李家政等[6]研究一致。

红肉蜜柚果实汁胞CAT、POD、SOD活性最低，MDA含量最高，是果实中膜脂过氧化伤害程度最严重的部位；结合取样观察，对照组果实汁胞40 d出现枯水现象，SOD和POD活性在40 d时降至最低点，而MDA在50 d时含量升至峰值，CAT活性降至最低点，表明对照组果实汁胞H2O2含量在40 d时开始出现失控状态，这个原因可能导致汁胞枯水的发生。细胞内适量的活性氧含量能调控防御机制，增强果实的抗氧化能力，如何控制果实内起调控作用的活性氧含量以增强果实的抗逆性，有待分子层面的进一步研究。

4 结论

果实的CAT、POD、SOD活性高低由外至内：外果皮>白皮层>汁胞。与对照组相比，随着贮藏时间的延长，冷藏能保持果实较高的酶活性，减少汁胞MDA和H2O2的积累；柚果在衰老过程中汁胞出现枯水，外果皮无明显表现，本次实验结果表明：果实外果皮的酶活性最强，H2O2含量随着贮藏时间的延长逐渐增加，MDA含量逐渐下降,贮藏至80 d，冷藏和对照组的H2O2含量分别上升了 1.25和1.24倍，MDA含量分别下降了2.4和4.1倍，表明果实的外果皮在贮藏后期仍具有较好的活性氧清除能力，保持了膜结构的完整，使果实的外果皮在贮藏过程中能保持较好的完整性。