富集黄酮的鸡腿菇栽培及营养成分分析

邹莉，马依莎，孙健，王世新，王旭彤，刘增才

(东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨，150040)

鸡腿菇(Coprinuscomatus)又名毛头鬼伞，隶属于鬼伞科(Coprinaceae)，鬼伞属(Coprinus)[1]。其肉质鲜嫩，清香味美。鸡腿菇具有蛋白质含量高、脂肪含量低、氨基酸种类丰富等特点[2]，经常食用可增强食欲、促消化[3]、提高免疫力[4]、抗肿瘤[5]、降血糖[6]、降血脂[7]等。鸡腿菇对栽培的营养条件要求不高，可以利用多种碳源和氮源，因此各种农作物都可以作为鸡腿菇栽培的原料。在实际生产过程中，常用棉籽壳、秸秆、酒糟、淀粉渣作培养基，原种培养基常采用麦粒、玉米芯、豆秸、麸皮等作为碳源，栽培种培养基通常是豆秸、麦麸等成分。研究发现，鸡腿菇生长过程对其营养成分含量有较大影响，不同的培养基质对它的营养也有较大的影响。食用菌能够从培养基中获取营养物质，对培养基中的微量元素、小分子活性成分具有良好的富集作用。娄钧翼等[8]在鸡腿菇培养基中加入蔗糖，显著提高了鸡腿菇分泌漆酶的能力。玉米作为食用菌培养基代料的研究多集中在玉米杆、玉米芯、玉米皮上，而关于利用玉米须栽培食用菌的报道较少。我国的玉米种植面积为2 350万hm2，玉米产量居世界第2位，估算玉米须的产量为700万t以上[9]。玉米须含有多糖、皂苷、黄酮、甾醇、氨基酸、生物碱等活性成分，是中国的一种传统中药材，具有利尿消肿、清肝利胆等作用[10]。其中，黄酮类化合物是玉米须的主要活性成分之一，具有降血糖[11]、抗癌[12]、抗菌[13]、清热利胆[14]等重要功能。玉米须来源丰富、价格低廉、易于采集收集、具有广阔的研究与开发前景[15-16]。

本研究对鸡腿菇进行了母种、原种和栽培种培养基配方的比较试验，筛选出最适合鸡腿菇生长的母种、原种和栽培种培养基配方。并将玉米须煮水后添加到栽培种培养基中，期望利用食用菌的富集效应，提高鸡腿菇中的黄酮含量，栽培出营养价值更高的鸡腿菇，为食用菌栽培原料的选择提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡腿菇(Coprinuscomatus)菌种由东北林业大学森林保护学科提供。

芦丁标准品、琼脂、葡萄糖、酵母粉、蔗糖、KH2PO4、MgSO4、过磷酸钙、苯酚、浓H2SO4、HCl、乙醇、乙醚、NaOH、NaNO2、重苯酚等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

马铃薯、红糖、麦粒、木屑、玉米芯、麸皮、玉米粉、豆秸，购自哈尔滨当地经销商。

1.2 供试培养基

1.2.1 母种培养基

马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA)培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，水1 000 mL。

1.2.2 液体种培养基

红糖培养基：去皮马铃薯150 g，红糖7.8 g，葡萄糖5.2 g，KH2PO41.04 g，D0.52 g，蛋白胨1.17 g，水1 000 mL。

马铃薯葡萄糖麦粒培养基：去皮马铃薯160 g,麦粒120 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL。

玉米粉培养基：玉米粉30 g，蔗糖20 g，酵母粉5 g，KH2PO42.5 g，MgSO41 g，水1 000 mL。

1.2.3 原种培养基组成成分(均为质量分数)

麦粒培养基：麦粒88%，木屑10%，石膏2%。

玉米芯培养基：颗粒状玉米芯88%，麸皮10%，石膏1%，蔗糖1%。

豆秸培养基：豆秸88%，麸皮10%，石膏1%，蔗糖1%。

1.2.4 栽培种培养基

对照配方为鸡腿菇生产常用的栽培种配方，在此配方中添加一定量玉米须作为原料[17-18]，设计鸡腿菇栽培种配方，具体配方见表1。按照表1配方称取原料，过磷酸钙和生石灰用水混合均匀后与豆秸、麦麸混合；玉米须放入锅中文火煮沸并保持沸腾20 min，然后将玉米须与水煮液加入到豆秸、麦麸中混匀。调节含水量至60%左右，闷堆24 h。每种配方分装到20个菌袋中，每袋装培养料500 g(干料约为200 g)，121 ℃高压蒸汽灭菌2 h。在无菌条件下，将鸡腿菇原种接种到栽培种培养基表面后放入25 ℃恒温培养箱中避光培养。

表1 栽培种培养基配方

单位：%(质量分数)

1.3 实验方法

1.3.1 液体种培养基筛选

按1.2.2配方制备液体种培养基，并将100 mL液体种培养基分别装入250 mL三角瓶中，灭菌后备用。在无菌条件下，将活化的母种接种在液体种培养基中，并在接种后置于恒温振荡器中。25 ℃、130 r/min 条件下培养7 d，获得试验用的液体种。每种配方设5组重复。分别测量液体菌种的菌丝体干重、菌丝球密度与直径。

1.3.1.1 菌丝体生物量的测定

将培养好的液体菌种摇匀后吸取50 mL，置于离心管中，2 000g离心20 min，并弃去上清液。蒸馏水充分洗涤菌丝体沉淀，用滤纸过滤，当滤液无色透明后收集菌丝体，80 ℃干燥至恒重，电子天平准确称量。以上操作重复3次，取平均值即为菌丝体的干重。按公式(1)计算：

(1)

1.3.1.2 菌丝球密度的测定

待液体菌种摇匀后，将1 mL菌液用无菌水稀释10倍，测定菌丝球个数(a)。重复取3次菌液进行稀释，测量稀释10倍后的菌丝球个数a1、a2、a3，计算菌丝球密度的平均值,按公式(2)计算：

(2)

1.3.1.3 菌丝球直径的测定

菌丝球大小可用菌丝球直径表示，菌丝球直径测量方法是取1 mL液体菌种用水稀释10倍，在培养皿中将20个菌丝球排成一行，并用卡尺测定总长度，重复测量3次，最后计算菌丝球直径的平均值。

1.3.2 原种培养基筛选

按1.2.3配方制备原种培养基，并将每种培养基分装到20个组织培养瓶中。在无菌条件下，将15 mL液体菌种接入到原种培养基中，置于25 ℃恒温培养箱中，避光培养直至菌丝长满组培瓶。观察记录鸡腿菇菌丝的生长情况，测量菌丝生长量(采用直线生长测量法)、记录菌丝浓密和粗壮程度及菌丝颜色，将经不同处理后的菌丝生长情况进行相互比较，并计算菌丝平均生长速率[19]，按公式(3)计算：

(3)

式中：菌丝生长量，mm；培养时间，d。

1.3.3 栽培种培养基筛选

观察记录鸡腿菇菌丝的生长情况，并测量菌丝生长量。待菌丝体长满菌袋后，采用室内不脱袋直立覆土的方式出菇[20-21]。记录原基形成和分化时间。待子实体成熟后，及时采收并测量子实体长度及菌柄直径，计算单袋(鲜菇)的平均产量和生物转化率[22],按公式(4)、(5)计算：

(4)

(5)

1.4 子实体营养成分测定

将经3种不同方式处理的鸡腿菇子实体烘干，粉碎，过80目筛，装于密封袋中备用。

1.4.1 黄酮含量的测定采用乙醇提取法

以芦丁标准品配制标准溶液，NaNO2-Al(NO3)3法显色后绘制标准曲线，样品用70%(体积分数)乙醇在60 ℃水浴下浸提4 h，显色反应后于510 nm波长下测定吸光度，并根据标准曲线计算黄酮含量(mg/g)[23]。

1.4.2 含水量的测定

采用105 ℃直接干燥法，具体步骤按 GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》第一法测定[24]。

1.4.3 粗总糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测量，100 ℃水浴下用HCl浸提3 h，测得吸光度后，换算得到总糖含量(mg/g)[25]。

1.4.4 粗蛋白含量的测定

采用凯氏定氮法，具体步骤参照GB 5009.5—2016，《食品中蛋白质的测定》第一法[26]。

1.4.5 粗脂肪含量的测定

采用索氏抽提法，具体步骤参照GB/T 5009.6—2016，《食品中脂肪的测定》第一法[27]。

1.4.6 粗灰分含量的测定

具体步骤参照GB 5009.4—2016，《食品中灰分的测定》第一法[28]。

1.5 数据处理

数据由SPSS 18.0统计软件进行One-Way ANOVA方差分析，每组数据重复3次。

2 结果与分析

2.1 液体种培养基配方筛选

由于液体培养基的流动性，使得各个菌丝片断可以在培养基的不同部位萌芽，菌种长满时间大幅度减少，因此液体种对于工业化生产鸡腿菇很有必要。液体种的质量与培养液外观和菌丝球密度有关，并且菌丝体生物量及菌丝球直径也会直接影响液体菌种的质量。本研究采用红糖、PD麦粒与玉米粉3种不同液体培养基以筛选出最佳液体培养基配方，结果如表2所示。

表2 不同液体种配方对菌丝生长的影响Table 2 Effects of different liquid culture mediums onmycelium growth

注：英文字母为不同配方间相同生长速率或菌落生长指数的差异性比较；同列数据后标不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著；同列数据后标不同大写字母表示在P<0.01水平差异显著(下同)

由表2可知，鸡腿菇菌丝的生长状况与液体种配方有很大关系。从培养液外观、菌丝球密度和菌丝球直径分析，PD麦粒培养基的菌丝球密度和菌丝体干重较低，不符合液体菌种生产要求，红糖培养基的菌丝球密度大，菌丝球直径适中，但红糖液体中的菌丝球大小不均匀。综合分析，供试的3种液体培养基配方中，以玉米粉为主要原料的配方效果最好，其菌丝体干重最大，菌丝球密度大且直径适中，菌丝生物量最大，适合作为液体菌种的培养基，符合生产要求。因此最适合鸡腿菇液体菌种的培养基配方为玉米粉培养基。

2.2 原种培养基配方筛选

由于母种和液体种的菌丝较为细弱，在栽培培养基中适应性较差，不适合用来直接栽培；因此，在原种培养基扩繁后，菌丝更为粗壮更能适应栽培种培养基的生长环境。本研究采用麦粒、玉米芯与豆秸3种不同培养基以筛选最佳原种培养基配方，结果如表3所示。

表3 不同原种配方对菌丝生长的影响Table 3 Effects of different original mediums onmycelium growth

注：+++表示程度高；++表示程度较高；+表示程度较低。鸡腿菇菌丝色泽分为褐、黄、淡黄、灰白、洁白 5 个等级(颜色越深表示菌丝生长状况越差)

由表3可知，不同的原种配方对鸡腿菇菌丝的生长状况和生长速率有较大影响。从菌丝生长状况分析，麦粒配方的菌丝浓密而粗大，生长状况最好；玉米芯配方和豆秸配方的菌丝粗壮程度相似，较细弱。从菌丝生长速率分析，麦粒配方的菌丝平均生长速率高于玉米芯和豆秸，差异极显著。综合分析，确定麦粒配方为鸡腿菇原种培养的最佳配方。

2.3 栽培种培养基筛选

食用菌栽培种生产对栽培的优质高产起着关键作用。栽培种培养料配方不同，菌丝生长情况以及出菇率也会不同。本研究采取按表1设置的3种不同鸡腿菇的栽培种培养基，以筛选出最佳配方，结果如表4与表5所示。

表4 不同栽培种配方对子实体形成的影响Table 4 Effects of different cultivation mediums onfruiting body formation

注：原基形成、子实体分化及成熟时间均为覆土后时间

由表4可知，鸡腿菇菌丝在3种配方上均可生长，菌丝粗壮洁白，但鸡腿菇的生长速率与栽培种的配方有关。配方Ⅰ与配方Ⅱ菌丝生长速率均高于对照，并且配方Ⅱ菌丝平均生长速率最快。子实体分化时间、子实体成熟时间由短到长顺序均为配方Ⅱ<对照<配方Ⅰ，配方Ⅱ的鸡腿菇从覆土到子实体完全成熟的时间比对照减少15.10%。

表5 鸡腿菇商品性状及产量Table 5 Commercial characters and yield ofCoprinus comatus

由表5可知，添加玉米须水煮液的2组配方栽培的鸡腿菇，在子实体长度、菌柄直径、产量及生物转化率方面与对照组有差异。子实体长度由长到短依次为配方Ⅱ>配方Ⅰ>对照，菌柄直径由长到短依次为对照>配方Ⅱ>配方Ⅰ。其中，配方Ⅱ的鸡腿菇子实体长，菌柄粗壮，商品性状最好，产量和生物转化率较高。配方Ⅰ和配方Ⅱ的产量和生物转化率均高于对照，且差异极显著；配方Ⅰ的产量和生物转化率均最高，但与配方Ⅱ差异不显著。综合子实体大小、菌柄直径、产量与生物转化率差异性分析，选择配方Ⅰ为栽培种的最佳配方。

2.4 子实体营养成分测定

2.4.1 黄酮含量分析

添加玉米须培养料的2组配方,栽培出的鸡腿菇的黄酮含量均高于对照组(表6)。配方Ⅰ和配方Ⅱ的黄酮含量分别为(21.29±4.45)、(16.52±0.26) mg/g，含量最高的是配方Ⅰ，比对照提高91.52%，配方Ⅱ的黄酮含量相比对照提高48.43%，配方Ⅰ的黄酮含量比配方Ⅱ提高了28.87%。结果表明，玉米须及其水煮液的添加增加了鸡腿菇黄酮含量，并且添加了4%(质量分数)的玉米须及其水煮液的配方黄酮含量最高。

表6 不同配方鸡腿菇的黄酮含量Table 6 Effects of different medium on flavone contentin Coprinus comatus

2.4.2 其他营养成分的含量分析

在添加玉米须水煮液的配方中，鸡腿菇的水分、总糖、蛋白质、脂肪含量均高于对照(表7)。其中，配方Ⅱ的水分和总糖含量最高，分别为(91.01±0.49)和(92.75±5.83) g/100 g，比对照组的(87.85±0.03)和(72.23±7.38) g/100 g高3.60%和28.41%。配方Ⅰ的蛋白质、脂肪还有灰分的含量最高，分别为(22.01±0.53)，(8.84±0.16)，(16.96±4.27) g/100 g，比对照组的(18.18±2.32)、(7.69±0.07)、(12.47±0.36) g/100 g高21.07%、14.95%、36.01%。结果表明，添加玉米须及其水煮液的培养料有利于提高鸡腿菇的营养价值。

表7 不同配方鸡腿菇的营养成分含量单位：g/100 g

3 结果与讨论

鸡腿菇在生长过程中能够利用多种栽培料，其菌丝生长、发育和子实体的产量、品质与栽培料密切相关。添加玉米须水煮液的配方，鸡腿菇菌丝生长速度高于对照组，同时，鸡腿菇商品性状生物转化率及水分、总糖、蛋白质、脂肪的含量均优于对照组。说明该配方对鸡腿菇生长有促进作用，这可能是由于玉米须中所含有的有机质及其他营养物质能够被鸡腿菇菌丝更好地吸收利用。

研究表明，食用菌在生长过程中对栽培基质中的营养成分具有富集作用[29-30]。试验结果表明，用添加玉米须培养料的2组配方栽培出的鸡腿菇黄酮含量均高于对照组。其中，添加4%(质量分数)玉米须水煮液的配方表现最为理想，配方Ⅰ鸡腿菇黄酮含量为(21.29±4.45) mg/g，与对照组相比增加了91.52%。这表明，鸡腿菇能够富集玉米须中的黄酮，且栽培料种类丰富时更有利于鸡腿菇的生长。而添加8%(质量分数)玉米须其黄酮含量比对照组提高48.43%，其他营养物质的含量同样均高于对照组，但其黄酮含量和产量均低于配方Ⅰ。4%和8%(质量分数)玉米须配方对鸡腿菇栽培产生差异的具体原因还需进一步研究。

综上所述，采用玉米粉液体配方、麦粒原种配方，豆秸和麦麸中添加4%(质量分数)玉米须及其水煮液的栽培种配方栽培鸡腿菇，能有效提高鸡腿菇生产效率，增加黄酮、总糖、蛋白质、脂肪等营养成分含量，为玉米须的资源化利用、鸡腿菇培养基配方的优化、提高鸡腿菇营养物质含量的提高提供参考依据。