miR-663对PG-LH7和PG-BE1细胞生长增殖和迁移侵袭的影响

王云朋, 刘章心怡, 张荣花, 赵 鹏, 章广玲, 刘志勇

(1.华北理工大学临床医学院， 河北 唐山 063000 2.中南大学湘雅医学院， 湖南 长沙 410013 3.华北理工大学基础医学院， 河北 唐山 063000)

肺癌是对人类生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌的病死率在许多发达国家以及我国许多大中城市已跃居常见肿瘤之首，占全部恶性肿瘤死亡的22.7%。miRNA影响肿瘤发生与发展的病理学机制已经很清晰，即其可在肿瘤发生与发展的过程中表现为抑癌基因或癌基因，而这有赖于其所调控的靶基因的生物学功能。关于miR-663在肿瘤中的研究主要侧重于其对于细胞生长，增殖，凋亡等的研究，而且主要是在鼻咽癌和胃癌细胞中进行的[1]。此外，miR-663还被认为是继miR-155之后的又一个联系炎症与肿瘤的桥梁miRNA分子[2]。本研究小组的前期研究中发现，miR-663可以通过抑制TGFB1的表达，从而促进肺癌A549细胞的增殖,因此，我们推测miR-663也可能影响肺癌细胞的恶性表型，如迁移和侵袭能力。本研究旨在利用转移能力不同的人肺巨细胞癌的低转移亚系PG-LH7和高转移亚系PG-BE1，探讨miR-663在PG-LH7细胞和PG-BE1细胞中的表达水平及对人肺癌细胞侵袭行为的影响。

1 材料与方法

1.1实验细胞:A549由中国医学科学院血液学研究所提供，PG-LH7和PG-BE1购自上海复祥生物。

1.2试剂和仪器:Lipofetamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，CCK-8试剂盒，购自日本同仁公司，transwell小室(8μm孔径聚碳酸酯膜)和Matrigel购自美国Corning Costar公司，miRNA第一链cDNA合成试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，二氧化碳细胞培养箱和1300 SERIES A2超净工作台购自美国thermo公司，SpectraMax190全波长读数仪购自美国Molecular Devices公司，实时荧光定量PCR仪Mastercycler ep Realplex4购自德国Eppendorf公司。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养:A549细胞在10%FBS、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640，PG-LH7和PG-BE1细胞系在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃含5%CO2的饱和湿度条件下培养。

1.3.3CCK8实验:实验分组，PG-LH7细胞:miR-663mimics组、control mimics组；PG-BE1细胞:miR-663 ASO组、ASO-NC组。用CCK8试剂盒检测miR-663对对PG-LH7和PG-BE1细胞增殖的影响，将两种细胞分别接种于96孔板，每组三个复孔，次日进行转染，每组重复三次，分别于24h，48h和72h加CCK8试剂10ul/孔，孵育3h后用酶标仪测定波长为450nm的吸光度值(即OD值)。

1.3.4软琼脂集落形成实验:5×103细胞混合在2×1640的1%琼脂中，接种于6cm直径的平皿中，每组三个复孔，并于37℃孵育。接中后第9天，计数大于50ge细胞的细胞克隆的个数。

1.3.5Transwell小室系统检测细胞迁移侵袭:Transwell小室中进行，在上室面铺Matrigel胶。实验分组，PG-LH7细胞:miR-663mimics组、control mimics组；PG-BE1细胞:miR-663 ASO组、ASO-NC组。在Matrigel上室面接种5×104个细胞/100uL，下室加入含10%血清的完全培养基。37℃、5%CO2条件下培养24h后，擦掉上室的细胞，用4%多聚甲醛固定30min，0.1%结晶紫染色20min，显微镜下计数5个不重复视野的穿膜细胞数。Transwell小室的聚碳酸酯膜上不铺Matrigel胶。

2 结 果

2.1miR-663在不同肺癌细胞系中的表达水平:miR-663在PG-LH7细胞中的表达低于A549细胞中的表达水平(P<0.05),miR-663在PG-BE1细胞中的表达高于A549细胞中的表达水平(P<0.05),见表1。

表1 miR-663在A549 PG-LH7和PG-BE1细胞系中的表达水平

注:与A549 细胞组相比, #P<0.05; 与A549 细胞组相比, *P<0.05

2.2miR-663ASO对PG-BE1细胞中miR-663水平的影响:miR-663 ASO实验转染组PG-BE1细胞中miR-663表达水平明显降低，与control ASO对照转染组相比均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3miR-663mimics对PG-LH7细胞中miR-663水平的影响:miR-663mimics实验转染组PG-LH7细胞中miR-663表达水平明显增高，与control mimics对照转染组相比均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 miR-663ASO对PG-BE1细胞中miR-663水平的影响

表3 miR-663 mimics对PG-LH7细胞中miR-663mRNA水平的影响

表4 miR-663对PG-LH7细胞和PG-BE1细胞细胞克隆形成的影响

注:PG-LH7细胞中与对照mimics组相比，*P<0.05；PG-BE1细胞中与对照mimics组相比，#P<0.05

2.4miR-663对PG-LH7细胞和PG-BE1细胞增殖的影响:软琼脂克隆形成(表4)及生长曲线实验(表5)，miR-663的高表达能够有效的促进PG-LH7细胞的增殖(P<0.05)。CCK8实验表明miR-663可以促进PG-LH7细胞的增殖，如图1A。

2.5miR-663对PG-LH7细胞和PG-BE1细胞侵袭迁移能力的影响:PG-LH7细胞中，miR-663组的侵袭迁移能力明显高于对照组(P<0.01)，PG-BE1细胞中，miR-663ASO组的侵袭迁移能力明显低于对照组(P<0.01)，见表6。

表5 miR-663对PG-LH7细胞和PG-BE1细胞生长的影响

表6 miR-663对PG-LH7细胞和PG-BE1细胞迁移侵袭能力的影响

注: 与对照组相比,#P<0.01；与对照组相比,*P<0.01

图1 CCK-8实验检测miR-663对PG-LH7细胞和PG-BE1细胞增殖的影响

3 讨 论

MiRNA是真核生物中一大类长度约22nt的非编码单链RNA分子，具有高度保守性。研究已经证实，同一个miRNA可能调控多个靶基因，而同一个靶基因也可能受到多种miRNA的调控[3]。miRNA分子参与了细胞的生长，发育及分化各个方面[4]。

已经发现miRNA分子可以调节癌基因或抑癌基因的表达，miRNA在炎症相关肿瘤发生和转移过程当中亦发挥重要作用[5,6]。miR-663还被认为是继miR-155之后的又一个联系炎症与肿瘤的桥梁miRNA分子，可以通过靶定eEF1A2抑制胰腺癌细胞的生长和侵袭[7]。因此，我们推测miR-663也可能影响肺癌细胞的其他恶性表型，如迁移和侵袭能力。

miR-663可以通过抑制TGFB1的表达，从而促进肺癌A549细胞的增殖。选取人肺腺癌细胞A549以及人肺巨细胞癌的低转移亚系PG-LH7和高转移亚系PG-BE1为研究模型，本文研究结果显示，转移能力不同的人肺巨细胞癌的低转移亚系PG-LH7和高转移亚系PG-BE1两种细胞中miR-663的表达确实存在明显的差异。深入分析miR-663对肺癌细胞转移能力的影响，结果提示miR-663调控了低转移亚系PG-LH7和高转移亚系PG-BE1细胞的侵袭迁移能力，但其具体的分子机制有待于进一步的实验研究。通过该项研究，为肺癌发生发展的具体分子机制提供了研究线索，并为肺癌的诊断和治疗提供新的治疗靶标。