公英解毒洗剂对下肢静脉性溃疡患者血清MMP-3及TIMP-1 表达的影响的研究

赵 波，王雁南，许永楷，梁 刚，李涵泊，张 玥，陈柏楠

下肢静脉性溃疡是多种下肢静脉性疾病的常见晚期并发症，如下肢静脉曲张、下肢深静脉血栓形成后遗症、原发性下肢深静脉瓣膜功能不全等。该病因静脉高压难以纠正，局部组织缺氧、感染及菌群失调、组织代谢障碍等问题而经久难愈，且易复发从而严重影响患者的生活质量，已成为当今医学界的一个难题[1-3]。公英解毒洗剂是山东中医药大学附属医院使用多年的经典外治方剂，经多年的临床检验证实其疗效显著、安全可靠，而且在前期的科研工作中已经从宏观角度对公英解毒洗剂治疗操作规范进行了系统性的研究，建立了标准化熏洗流程，并对肢体慢性溃疡病人熏洗前后疮面溃疡周围血流灌注量、氧分压变化情况进行了监测。但从微观角度，对公英解毒洗剂的作用机制及作用靶点尚有待观察研究。本研究旨在通过监测基质金属蛋白酶-3（MMP-3）和基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的动态变化，从分子生物学角度阐述公英解毒洗剂的作用机制及作用靶点，为公英解毒洗剂的临床推广应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 病例来源 选取山东中医药大学附属医院周围血管病科2016 年5 月1 日—2018 年5 月31日收治的下肢静脉性溃疡患者75 例。发病部位左下肢36 例，右下肢29 例，双下肢10 例；病因下肢静脉曲张32 例，下肢深静脉瓣膜功能不全16 例，下肢深静脉血栓形成后遗症25 例，下肢静脉畸形2 例；溃疡病程3～42 个月。应用随机数字表分为对照组25 例，复方黄柏液组25 例，公英解毒洗剂组25 例。对照组25 例中男15 例，女10 例；年龄54～78（59.1±4.5）岁；复方黄柏液组25 例中男12 例，女13 例；年龄49～71（59.4±6.6）岁。公英解毒洗剂组25 例中男11 例，女14 例；年龄44～77（60.5±8.3）岁。三组患者年龄、性别构成差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有患者均签署知情同意书。

1.1.2 诊断标准 参照国家中医药管理局制定的《中医病证诊断疗效标准》进行诊断：（1）以小腿内侧多见。（2）局部初起常先痒后痛，色红，糜烂，迅速转为溃疡。溃疡大小不等，呈灰白或暗红色，表面或附有黄色脓苔，脓水秽臭难闻。病久溃疡边缘变厚高起，四周皮色黯黑，漫肿或伴有湿疹，收口后易反复发作。（3）多见于下肢患有筋脉横解（静脉曲张）的患者。

1.1.3 纳入标准 （1）符合上述下肢静脉性溃疡诊断标准者。（2）溃疡面积≤20 cm2。

1.1.4 排除标准 （1）动脉缺血性溃疡，如糖尿病肢体动脉闭塞症、血栓闭塞性脉管炎、闭塞性动脉硬化症等发生溃疡者。（2）踝肱指数（ABI）＜0.8。（3）坏死性血管炎等变态反应性疾病伴有皮肤溃疡者。（4）特异性溃疡，如神经性溃疡、放射性溃疡等。（5）合并严重化脓性感染者，如脓毒血症。（6）合并严重心、肝、肾疾患及恶性肿瘤、血液系统疾病、结缔组织疾病和精神类疾病者。（7）有外治疗法禁忌证者。

1.2 研究方法

1.2.1 公英解毒洗剂（批件号：鲁药制再注20090125）方药组成及使用方法 （1）方药组成：蒲公英30 g，黄柏、连翘、苦参、木鳖子各12 g，金银花、丹皮、赤芍、白芷、甘草各10 g。（2）加工及使用方法：中药饮片购自山东中医药大学附属医院，用自动煎药机（北京东华原医疗设备有限责任公司）煎煮成100 mL 的袋装浓缩液。

1.2.2 治疗方法 在给予患者基础疾病对症治疗的基础上，按研究方案进行创面的局部治疗。基础治疗包括中药汤剂内服，口服及静滴活血化瘀中成药；合并感染者针对脓培养药敏结果应用抗生素静滴；糖尿病患者予以检测血糖并降糖治疗；心脑血管患者予以监控血压并适当应用降压药等。（1）对照组：创面进行常规清洁换药，创面周围以酒精棉球消毒，创面内以0.9%生理盐水棉球蘸拭后，无菌包扎。（2）复方黄柏液组和公英解毒洗剂组：创面周围以酒精棉球消毒，创面内以0.9%生理盐水棉球蘸拭后，然后应用复方黄柏液、公英解毒洗剂分别进行湿敷治疗，无菌包扎。两组治疗频率均为每天1 次，均于治疗的第1、7、14天观察疗效性指标，并抽取血液标本。

1.2.3 疗效性指标 （1）创面愈合情况观察：于治疗第1、7、14 天，观察创面颜色、渗液量、肿胀程度等。（2）创面愈合率：应用数码相机拍照，ImageJ2x 软件记录创面面积并计算创面愈合率=（创面初始面积－给药后第n 天创面面积）/创面初始面积×100%。（3）炎症因子水平检测：于治疗第1、7、14 天抽取患者足背静脉血10 ml，置于肝素抗凝管中，送山东中医药大学附属医院检验科应用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测MMP-3、TIMP-1 及超敏C-反应蛋白（hs-CRP）水平。

2 研究结果

2.1 创面愈合率 治疗第7 天，创面愈合率由高到低依次为：公英解毒洗剂组＞复方黄柏液组＞对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗第14天，公英解毒洗剂组和复方黄柏液组的创面愈合率均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），但公英解毒洗剂组与复方黄柏液组差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组治疗不同特点创面愈合率的比较

2.2 血清中hs-CRP 的表达 治疗第1 天，三组血清hs-CRP表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗第7 天，三组血清hs-CRP 由高到低依次为：对照组＞复方黄柏液组＞公英解毒洗剂组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；治疗第14 天，复方黄柏液组和公英解毒洗剂组的血清hs-CRP 均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），但公英解毒洗剂组与复方黄柏液组差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组不同时点血清中hs-CRP 含量比较 （mg/L）

2.3 血清中MMP-3 的表达 治疗第1 天，三组间血清中MMP-3 水平差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗第7 天，MMP-3 表达水平由高到低依次为：对照组＞复方黄柏液组＞公英解毒洗剂组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；治疗第14 天，复方黄柏液组和公英解毒洗剂组的血清MMP-3 均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），但公英解毒洗剂组与复方黄柏液组血清中MMP-3 的表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 各组不同时点血清中MMP-3 含量比较(μg/L)

2.4 血清中TIMP-1 的表达 治疗第1 天，三组间TIMP-1 表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗第7 天，TIMP-1 表达水平由高到低依次为：公英解毒洗剂组＞复方黄柏液组＞对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗第14 天，复方黄柏液组和公英解毒洗剂组的TIMP-1 水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），但公英解毒洗剂组与复方黄柏液组血清中TIMP-1 水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 各组不同时点血清中TIMP-1 含量比较 (μg/L）

3 讨论

近年来，随着人们生活方式的改变和人口的老龄化，下肢静脉性溃疡的发病率正以惊人的速度逐年增加，因其病程长、涉及学科多、发病机制复杂、治疗难度大且治疗费用高等特点，严重影响着患者的生活和工作，加重了家庭和社会负担，成为创面修复领域研究的重点和难点[4-5]。下肢静脉性溃疡创面修复涉及诸多因素，近年来研究表明基质金属蛋白酶（MMPs）是参与细胞外基质（ECM）降解的主要酶蛋白家族，在伤口愈合、血管增生等正常生理过程中，参与基质蛋白的细胞外降解和分解，促使细胞穿越基底膜[6-8]。现代研究发现MMP-3 也称基质溶素-1，其能够降解多种ECM 成分，参与组织形态发生、创面修复、炎症反应等生理、病理过程，其水解底物包括III、IV、V、IX 型胶原，蛋白聚糖、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等，是一种重要的细胞外基质调节酶[9-10]。MMP-3 能通过水解各种ECM 成分而激活其他的MMPs（如MMP1、7、8、13、9等），因而被认为其在MMPs 的生物活性中起始动作用[11-12]。MMP-3 的表达可见于组织创伤后的不同时间段，有研究显示甚至在创伤后28 天仍可检测到MMP-3 的表达，表明MMP-3 不仅参与了ECM 降解而且也与创面修复、ECM 重塑和组织改建密切相关，并可能参与慢性炎症中活性调节进而影响创伤愈合延迟或纤维化等。基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）是一组低分子质量的蛋白，广泛分布于组织和体液中，可由成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等产生[13]。目前发现的TIMPs家 族 成 员 有4 种：TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。其中TIMP-1 能被多种细胞因子诱导产生，以可逆的非共价键形式按1:1 比例与MMP-3结合成复合物。此外TIMPs 是多功能分子，不仅具有细胞生长因子样作用，还能促进成纤维细胞增生及胶原合成，使ECM 沉积并抑制其降解，调控ECM 代谢和抑制血管的生成等作用。MMPs与TIMPs 是胶原代谢的主要调节物质，两者相互作用共同维持着溃疡肉芽组织基质的分解与重构[14-15]。MMP-3、TIMP-1 是目前国内外研究的热点，可较客观的反映溃疡肉芽组织的生物学状态，判定疾病的预后。

中医学对下肢静脉性溃疡的治疗有着悠久的历史，“祛腐生肌”是中医外科疮疡外治过程中的独特经验和方法，也是中医辨证论治思想在外科证治中的生动体现，其中具有代表性的山东中医药大学附属医院验方“公英解毒洗剂”经40余年临床经验证实疗效显著、安全可靠。王雁南等[16]应用公英解毒洗剂治疗静脉性溃疡治愈率28.95%，显愈率71.05%，有效率97.37%，临床效果显著。在药理方面目前国内对公英解毒洗剂的单味药物的药理研究比较多，如公英解毒洗剂中的主要成分为蒲公英，苦参、黄柏、连翘、金银花、赤芍、白芷、木鳖子等，功效为清热解毒、消肿止痛[17]。方中前六位中药均有清热解毒的功效，现代研究提示其均有广谱抗菌作用，其中蒲公英、苦参、黄柏、金银花对抑制葡萄球菌的生长尤为突出[18]。此外赤芍还可散瘀消肿，入肝经血分以活血散瘀止痛，现代药理显示其具有抗凝、抗血栓作用。木鳖子可消肿散结，攻毒疗疮，有抑制葡萄球菌及化脓链球菌、抗病毒、抗炎作用。但是一剂中药的功效并不是单味药物功效的简单叠加，而是一个复杂的生物和化学变化的过程，虽然前期的临床研究已经对不同温度、浓度公英解毒洗剂治疗下肢静脉性溃疡的疗效进行了系统的研究和总结，对其促进糖尿病溃疡愈合的机理进行了初步的总结和分析，但总体而言其疗效机理的研究还仅仅局限在抗菌、消炎、改善微循环等方面，对外用药物具体的疗效机制、作用靶点及干预组织修复方面，尤其是从信号通路及分子生物学的角度和深度有待进一步的研究和总结。因此，本课题选取山东中医药大学附属医院的验方“公英解毒洗剂”和目前已广泛应用于临床的上市药物“复方黄柏液”，以这两种临床疗效确切的外用药作为代表药物，通过测定足背静脉血中不同时期MMP-3、TIMP-1 蛋白的表达情况，探讨公英解毒洗剂的作用机制、作用靶点及下肢静脉性溃疡难愈合的分子机制，从而为疾病的治疗提供理论依据和数据支持。

本研究通过统计分析发现，治疗的第7、14 天，公英解毒洗剂组与复方黄柏液组血清中hs-CRP 和MMP-3 的表达显著低于对照组，表明hs-CRP 与MMP-3 都可以反映机体炎性反应的状况，具有较高的灵敏度。另外，hs-CRP 的表达变化也更加证实了公英解毒洗剂可有效抑制炎症反应，是炎性反应早期的首选药物。而MMP-3、TIMP-1 通过对ECM 的降解以调控创面肉芽组织的过度增生。公英解毒洗剂组和复方黄柏液组的创面愈合率高于对照组，提示公英解毒洗剂和复方黄柏液均有清热解毒祛腐的功效，符合传统中医外科“祛腐生肌”的理论。再有，研究结果显示公英解毒洗剂组的MMP-3、hs-CRP 表达均低于复方黄柏液组，表明公英解毒洗剂在抑菌、抗炎方面的功效优于复方黄柏液，值得临床推荐。但本课题尚未引入“生肌”类药物进行比较，因此对下肢静脉性溃疡难愈合的因素尚需进一步的研究。