核转录因子κB、P53 在膀胱癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

高 超，高 燕，杜张敏，付 曦，黄国军

膀胱尿路上皮癌是常见的恶性肿瘤，具有多发性和高复发率的特点。据估计2012 年北美大约有142 170 例膀胱癌新发病例[1]。膀胱癌在实体恶性肿瘤中的发病率排在第四位，且好发于男性，男女比例约为4∶1[2]。目前膀胱癌的确切发病及复发的分子机制并不十分清楚。目前认为与患者整个膀胱黏膜上皮基因组不稳定性有关。核转录因子κB（NF-κB）可以与细胞核内DNA 顺式作用元件相结合，启动DNA 转录，在多种肿瘤中其表达水平升高，且与肿瘤的预后不良有关。P53是经典的肿瘤抑制基因。几乎在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现P53 基因的突变。P53 基因编码的蛋白质是一种转录因子，控制着细胞周期的启动。当细胞受损，且无法得到修复时，P53 蛋白将参与启动过程，使细胞进入凋亡程序。本研究采用免疫组织化学SP 法检测NF-κB 和P53 蛋白在膀胱移行上皮癌中的表达，并探讨其表达与患者临床特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014 年2 月—2017 年1 月成都市郫都区人民医院确诊并手术的膀胱移行上皮癌患者48 例。纳入标准：病理学确诊为膀胱尿路上皮癌者，术前未接受过放化疗，临床病例资料完整，术后随访资料齐全。排除标准：其他病理类型的膀胱癌患者，合并其他恶性肿瘤者。选择同期因膀胱良性病变行手术治疗的非膀胱癌患者16 例，均无恶性肿瘤病史。

1.2 仪器与试剂 一抗：鼠抗人NF-κB，兔抗人P53 单克隆抗体（购自美国Santa Cruz 公司）；即用型免疫组化SP 试剂盒（购自北京中山生物技术公司），微波炉（购自格兰仕公司），微量加样仪（购自德国Eppendor 公司）。

1.3 检测方法 采用免疫组织化学SP 法检测膀胱癌组织、癌旁组织及非膀胱癌患者正常尿路黏膜组织中NF-κB 和P53 蛋白的表达水平。首先对切片进行脱蜡和水化，然后进行抗原修复后，应用PBS 洗2 次，加正常山羊血清封闭，室温20 min，后甩去液体，加一抗（NF-κB 或P53），4 ℃过夜。过夜后37 ℃复温45 min，PBS 清洗3 次后加二抗，37 ℃，1 h，PBS 清洗后加入SP 液室温20 min。DAB 显色10 min，显微镜下观察染色程度。苏木精复染2 min，脱水、封片然后置显微镜下进行观察。

1.4 观察指标与评价标准 观察癌组织、癌旁组织和正常膀胱尿路上皮组织中NF-κB 和P53 的表达水平；记录患者年龄、性别、肿瘤分级、临床分期及淋巴结转移情况。NF-κB 阳性染色多位于癌细胞胞浆内，散在分布于核内，呈棕黄色颗粒或团块，弥漫分布。P53 蛋白表达主要分布在细胞核和细胞质中，呈棕黄色颗粒状。根据Handel 等[3]的分级标准双盲法计分：＜5%为-，5%～25%为+，26%～49%为++，≥50%为+++。

1.5 统计学分析 数据分析采用STATA12.0 软件完成，计量资料采用表示，组间比较采用t检验，计数资料采用例（%）表示，组间比较采用卡方检验或fisher 确切概率法。无疾病进展生存时间（Disease free survival, DFS）等采用中位数表示，组间比较采用Log-rank 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果 NF-κB 阳性染色多位于癌细胞胞浆内，散在分布核内，呈棕黄色颗粒或团块，弥漫分布；P53 蛋白表达主要分布在细胞核和细胞质中，呈棕黄色颗粒状，图1。

图1 NF-κB 和P53 表达情况

2.2 NF-κB、P53 蛋白在癌、癌旁及正常黏膜组织中的表达 膀胱癌组织的NF-κB 和P53 蛋白阳性率高于癌旁组织和正常黏膜组织，癌旁组织的NF-κB 和P53 蛋白阳性率高于正常黏膜组织，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 NF-Kb、P53 蛋白表达与患者临床病理特征的关系 NF-κB 阳性表达与膀胱癌患者肿瘤病理分级存在相关性，高级别膀胱癌（G2/G3）组织中NF-κB 阳性率显著高于低级别（G1）肿瘤组织（P＜0.05）；P53 阳性表达与膀胱癌患者肿瘤分期存在相关性，T2-3期患者阳性率显著高于Tis-1期（P＜0.05），见表2。

表1 各组织中NF-κB、P53 蛋白阳性表达情况比较

表2 NF-κB、P53 蛋白表达与患者临床病理特征的关系

2.4 蛋白表达表达与DFS 的关系 NF-κB 表达阳性和阴性患者的中位DFS 分别为8.9 个月和30.1 个月，阳性组复发风险显著高于阴性组[HR=2.14，95% CI=1.05 ～4.33 (P＜0.05)]；P53 表达阳性和阴性患者的DFS 分别为9.2 个月和28.6 个月，阳性组复发风险显著高于阴性组[HR=2.02，95%CI=1.22 ～3.62(P＜0.05)]，表3，图2。

表3 NF-κB、P53 蛋白表达与DFS 的关系

图2 NF-κB、P53 表达与肿瘤复发风险的关系

3 讨论

膀胱癌是我国泌尿系统中最常见的恶性肿瘤[4]。由于其具有多发性、癌旁黏膜存在癌前病变的特点，治疗后的复发率仍高达30%～50%[5-6]，给患者及家庭带来极大的健康和生活压力。目前，膀胱癌发生发展的确切分子机制并不十分清晰。近年来的研究显示，DNA 损伤-修复平衡在膀胱癌的发生中发挥重要作用[7-9]。DNA 损伤后的及时修复在维持基因组的稳定性、防止肿瘤的发生起关键作用。有研究报道DNA 损伤反应可通过下面两条途径来监控肿瘤的发生：（1）ATM/CHK2/p53 通路诱导细胞周期停滞、DNA 修复和凋亡；（2）ATM/NKG2DL 通路诱导抗肿瘤免疫。研究认为，实体恶性肿瘤普遍存在p53 基因突变或其他DNA修复、凋亡相关分子功能异常[10-11]。

NF-κB 为一个转录因子蛋白家族，包括5个 亚 单 位：Rel（cRel）、p65（RelA，NF-κB3）、RelB 和p50（NF-κB1）、p52（NF-κB2）[12]。NF-κB 的抑制单位IκB 通过其C 末端特定的锚蛋白重复序列（ankyrin repeat motif）与NF-κB结合，并覆盖NLS 阻止NF-κB 向细胞核内转移。在静息的细胞中，NF-κB 和IκB 形成复合体，以无活性形式存在于胞浆中。当细胞受细胞外信号刺激后，IκB 激酶复合体（IκB kinase，IKK）活化将IκB 磷酸化，使NF-κB 暴露核定位位点。游离的NF-κB 迅速移位到细胞核，与特异性κB序列结合，诱导相关基因转录[13]。已有研究表明[14-15]，有多条信号通路参与MICA 的表达调控。对活化的T 淋巴细胞和宫颈癌HeLa 细胞MICA蛋白表达机制的研究发现，MICA 基因第1 内含子含有转录因子NF-κB 结合位点，NF-κB 抑制剂PDTC 能抑制MICA 蛋白表达，而且转染NF-κB基因到HeLa 细胞能上调MICA 表达，表明MICA可能是NF-κB 的靶基因[16]。前面提到，一些DNA 损伤剂可通过ATM 介导的DNA 损伤反应途径上调NKG2DL 表达，而ATM 介导的DNA 损伤反应又可诱导NF-κB 活化[17]，因此，笔者推测NF-κB 可能是联系DNA 损伤反应和MICA 表达的中介分子。ATM 诱导NF-κB 活化的信号通路已基本清楚，探讨ATM/NF-κB 通路对MICA表达的调控作用将为监控膀胱癌的复发和进展提供新靶点。可溶性MICA 蛋白（sMICA）形成是肿瘤实现免疫逃逸的新机制，患者血清和尿液中sMICA 是否可作为新的膀胱癌标志物也是值得探讨的问题。另有NF-κB 可以通过与细胞核DNA结合启动某些基因的转录，从而调控细胞的增殖、分化及凋亡[18]。在多种恶性肿瘤细胞如胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌及结直肠癌中均可检测到NF-κB 的异常变动，且其异常表达与肿瘤的预后不良有关。

本研究分析了48 例膀胱癌患者癌组织、癌旁组织和非膀胱癌患者正常尿路黏膜组织中NF-κB和P53 蛋白阳性表达情况，发现癌组织中NF-κB和P53 阳性率显著高于癌旁组织和非肿瘤患者正常膀胱黏膜组织，提示NF-κB 和P53 在膀胱癌的发生发展中可能发挥重要作用。同时本研究还发现NF-κB 与膀胱癌患者肿瘤病理分级有关，高级别膀胱癌（G2/G3）组织中NF-κB 阳性率显著高于低级别（G1）肿瘤组织。而P53 与膀胱癌患者肿瘤分期存在相关性，T2-T3期患者阳性率显著高于Tis-T1 期。提示NF-κB 和P53 的阳性表达可能与肿瘤的恶性程度及侵袭能力有关。但其确切相关性有待进一步的分子生物学实验证实。同时，本研究分析了NF-κB 和P53 蛋白表达与患者DFS 的关系，结果提示NF-κB 和P53 阳性表达组的DFS 显著小于阴性组，说明NF-κB 和P53可作为膀胱癌术后复发预测的潜在分子标志物。