茶多酚对成骨细胞活性氧自由基氧化损伤的影响

谢山周 王佳慧 虞芳梅 黄敏华 黄海冰 韦慧玲 刘海微 赵越超 曹振（通讯作者）

（桂林医学院生物技术学院 广西 桂林 541100）

氧化应激(Oxidative Stress，OS)是指机体内的氧化与抗氧化功能失衡，是机体氧自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素[1]。茶多酚具有强的氧自由基清除能力[2]。因此，本实验通过检测受氧化应激损伤的体外培养成骨细胞在茶多酚（Tea PolyPhenols，TPs）干预下的增殖活性和成骨分化相关指标，来确定可对抗细胞损伤的茶多酚最佳浓度，并探明其过程和氧化应激方面的机理，为茶多酚在相关骨病的治疗药物开发上提供实验依据。

1.资料与方法

1.1 溶液配制

用完全培养基配制不同终浓度的茶多酚母液(10 ～1μg/mL、100μg/mL、101μg/mL)。用磷酸盐缓冲液(PhosPhate Buffered Saline，PBS)配成终浓度为10 ～5mol/L 的过氧化氢（hydrogen Peroxide，H2O2）。

1.2 药物处理及成骨细胞增殖和分化指标检测

H2O2 处理成骨细胞作为对照组，在H2O2 处理的基础上分别添加不同浓度的茶多酚母液作为药物组，通过MTT 法检测成骨细胞增殖，试剂盒检测成骨细胞培养液上清碱性磷酸酶（alkaline PhosPhatase，ALP）活性及矿化沉积染色。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS18.0 统计软件进行统计分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（±s）表示，进行t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 不同浓度茶多酚对氧化损伤后成骨细胞增殖的影响

与10 ～5mol/LH2O2对照组相比，10 ～1μg/mL、100μg/mL 茶多酚干预72h 后，氧化损伤后的成骨细胞OD 值显然升高，10 ～1μg/mL TP 组尤为显著，表示低浓度的TP 氧化损伤后的成骨细胞增殖有促进作用（P＜0.05）；浓度101μg/m TP 处氧化理组干预72h 后，死细胞漂浮多，与对照组相比OD 值显然降低，说明高浓度TP 对损伤后的成骨细胞增殖有抑制作用（P＜0.05）(图A)。

2.2 不同浓度茶多酚对氧化损伤后成骨细胞培养液上清ALP 活性的影响

与 10 ～ 5mol/L H2O2对照组相比，10 ～ 1μg/mL、100μg/mL、101μg/mL 茶多酚干预3 天后，各浓度组的ALP活性均没有显著差异(P＞0.05)；茶多酚干预6 天后，10 ～1μg/mL、0.1 μg/mL 浓度组ALP 活性较对照组显著升高（P＜0.05）（图B）。说明较低浓度的茶多酚对氧化损伤后成骨细胞培养液上清ALP 活性有促进作用，药物作用效果表现出时间依赖性。

2.3 不同浓度茶多酚对氧化损伤后成骨细胞矿化沉积染色结果的影响

与10 ～5mol/L H2O2对照组和其他各组相比，10 ～1μg/mL 茶多酚处理组的钙结节区域较大（图C2 红色箭头处）。

图A 不同浓度茶多酚对氧化损伤后成骨细胞增殖的影响图B 不同浓度茶多酚对氧化损伤后成骨细胞培养液上清ALP 活性的影响

图C 不同浓度茶多酚对氧化损伤成骨细胞矿化沉积染色结果的影响xi

3.讨论

茶多酚类物质的抗氧化生物学活性，己被广泛应用于临床的各个领域，如抗癌、降低血脂、预防动脉粥样硬化和心血管疾病发生等等[3]。骨质疏松病理机制的一个重要方面是成骨细胞的增殖与骨向分化受到抑制，从而使骨小梁变得稀疏、断裂，骨质量和骨量均下降[4]。茶多酚对骨细胞的影响与茶多酚的抗氧化性密切相关。

本实验以过氧化氢作为氧自由基，构建氧化损伤成骨细胞模型，以不同浓度的茶多酚作为实验组，结果表明：低浓度（0.1 μg/mL）茶多酚对氧化损伤成骨细胞有增殖作用，而高浓度TP有相反作用。低浓度的茶多酚可以使氧化损伤成骨细胞的碱性磷酸酶的活性提高，并使得氧化损伤成骨细胞矿化沉积增多，从而影响成骨细胞的分化。

综上所述，0.1 μg/mL 的茶多酚可削弱成骨细胞活性氧氧化损伤，促进成骨分化。