Anammox反应器启动前后微生物群落结构差异性

2020-02-25袁林江

工业微生物 2020年1期

严锋，张方，袁林江

1.广州资源环保科技股份有限公司，广州 510699；2.中信环境技术(广州)有限公司，广州 510660；3.西安建筑科技大学，西安 710055

Anammox菌增殖速度慢，使得反应器启动时间长而且难以富集功能菌，因此该工艺的大规模应用受到很大限制[1]。UASB(upflow anaerobic sludge blanket)反应器具有构造简单、污泥截留能力强，培养的污泥沉降性能好，耐负荷波动强等优点，常作为Anammox快速启动反应器[2-4]。但UASB反应器中污泥床在上升流速较低产气量不足时，污泥床致密易导致基质传递效果不良等问题[5]，从而影响反应器运行效果。

生物反应器的运行及对底物的降解都依赖于系统微生物的组成及其功能。高通量测序技术能对污泥中微生物进行全面细致的分析，数据量庞大。该技术在环境微生物研究领域得到广泛应用[6-7]。在Anammox研究中也取的很好的效果[8]。本文研究了Anammox-UASB的启动和上升流速对反应器脱氮的影响，以期为Anammox-UASB的快速启动与高效运行提供理论指导和依据；采用高通量测序技术对微生物群落结构进行了解析，旨在为Anammox反应器启动过程微生物群落变化规律提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验装置及废水组成

实验装置采用图1所示的有效容积为6.3 L的UASB反应器，利用温控装置和水泵控制反应器温度为33 ℃，外壁包裹黑布以防止光照对Anammox菌产生不利影响。

实验用水组成：KHCO31 000 mg/L;KH2PO427mg/L;CaCl25.6 mg/L;MgSO4·7H2O 200 mg/L;(NH4)2SO4和NaNO2按需添加；微量元素Ⅰ和Ⅱ[9]各1 mL。

图1 Anammox-UASB装置原理图

1.2 接种污泥与高通量测序污泥采集和保存

反应器接种市政污水厂回流污泥，起始污泥MLSS=7 787 mg/L，MLVSS=5 244 mg/L。经短期反硝化预培养后开始Anammox驯化。高通量测序污泥样品为接种污泥(Y1)与Anammox培养180 d的污泥(Y2)。

1.3 分析方法

基于Illumina MiSeq测序平台的细菌16S rDNA高通量测序分析交由生工生物工程公司进行测序。

2 结果与讨论

2.1 Anammox反应器启动及负荷的提高

图2 Anammox-UASB启动过程脱氮性能

2.2 N冲击负荷对Anammox-UASB的影响

图3 Anammox脱氮影响研究

2.3 上升流速对Anammox脱氮的影响

图4 上升流速对系统脱氮性能影响

2.4 Anammox反应器启动前后微生物群落结构的差异性

利用Illumina Miseq平台对实验接种污泥(Y1)和Anammox污泥(Y2)进行高通量测序，分析微生物种群结构变化。

2.4.1菌群Alpha多样性分析

表1为菌群分布的Alpha多样性相关指标。可以看出，Anammox污泥菌群OTU数量、Shannon指数、Simpson指数及ACE指数均表明Y1群落的Alpha多样性Y2群落多样性减少。作为小型生态系的活性污泥系统中某一功能的提高通常伴随着系统整体微生物多样性下降和某些功能菌丰度值提高[13]。反应器接种污泥来源于城市污水厂，其处理废水成分复杂并经过厌氧、缺氧、好氧交替运行环境，微生物群落结构复杂。而在长时间的厌氧自养培养过程中，好氧菌以及异养菌等因DO和有机物缺乏而不适应该环境，此类微生物易衰亡或从反应器流失，适应Anammox培养环境的微生物继续生长繁殖。

表1 污泥样品的Alpha多样性

2.4.2菌群结构分析

(1)门分类水平上的分析

将Y1和Y2测序所得全部有效序列进行聚类分析得到的OUT进行分类学分析，统计得到污泥菌群在门水平上的群落组成。在Y1中共检测到23个菌门，相对丰度大于1%的门占10个；Y2中共检测到21个菌门，相对丰度大于1%的只有5个门。表2显示了污泥样品主要菌门及其相对丰度情况。在Y1和Y2中，变形菌门(Proteobacteria)微生物相对丰度都是最大的，分别高达50.54%和74.39%，这与大多数的anammox反应器系统菌群分布相一致[8,14]。高晨晨[15]研究了9座污水厂活性污泥群落结构时发现Proteobacteria均主导菌门。其主要原因是，参与脱氮及诸多污染物质的降解过程的微生物大都归属于Proteobacteria[6]。在Y2中，浮霉菌门(Planctomycetes)的相对丰度为3.92%，而Y1中该门的相对丰度为4.36%。目前发现的Anammox菌均为Planctomycetes微生物，但Y2中的Planctomycetes相对丰度较Y1却有所下降，其因为为浮霉菌普遍存在于城市污水处理厂污泥系统中，但是该菌门中具有Anammox脱氮功能的只有6个属[16]，在Y1中检测到的具有Anammox功能的菌属几乎没有，但Y2中检测到大量的Candidatus_Jettenia和Candidatus_Brocadia属(图5)，并且随着自养厌氧培养一些不适应环境的腐霉菌在大量的流失消亡。厚壁菌门(Firmicutes)细菌多能产生芽孢，对不良环境有较好的抵抗力，对环境有较好的适应力[16]，在Anammox启动过程丰度大量增加。

表2 反应器接种污泥(Y1)与Anammox污泥(Y2)菌群门水平分析

(2)属分类水平上的分析

为了更深入的了解污泥群落结构特征，对测序结果在属水平做了如下分析。图5是污泥样品中相对丰度较高(>1%)的属的分布情况。Y1中共检测到446个属，相对丰度大于1%的属有25个；Y2中共检测到259个属，相对丰度大于1%的有11个属。Y1中菌群结构较为复杂并且各种菌属的相对丰度较为相对均衡，而Y2菌群结构相对简单。Y1中有关脱氮的菌属主要有Acinetobacter(3.61%)、Denitratisoma(3.36%)、unclassifiedNitrosomonadaceae(2.03%)、Nitrosomonas(0.12%)、Nitrosococcus(1.26%)、Nitrobacter(0.11%)、Nitrospira(1.77%)、Azoarcus(0.91%)、Sulfuritalea(0.85%)，未检测到具有Anammox功能的菌属。Y2中相关脱氮菌属主要有Acinetobacter(54.63%)、Nitrosomonas(4.67%)、CandidatusJettenia(2.48%)、Denitratisoma(2.43%)、unclassifiedNitrosomonadaceae(0.32%)、CandidatusBrocadia(0.84%)、Azospira(0.67%)、Nitrobacter(0.15%)、Hyphomicrobium(0.58%)，其中CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia两个属为典型的Anammox菌属。Anammox污泥中不动杆菌属呈现绝对优势，占整个菌群的54.63%，增长极为明显；在Anammox培养中，系统中的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)也大量增长，相对丰度有接种时的0.12%增加到4.47%，接种污泥中含有未分类的亚硝化单胞菌科(unclassifiedNitrosomonadaceae)中的细菌在培养过程中有所减少；红环菌科中的Denitratisoma属是典型的反硝化菌，在接种污泥和Anammox污泥中相对丰度均较高，分别为3.36%和2.43%，反硝化菌的存在有利于维持反应器内部厌氧水平[17]，有利于系统的稳定运行。对于Planctomycetes中的细菌，Y1中Planctomycetes的相对丰度为4.36%，但具有Anammox功能的属只占该门的0.015%，丰度极小。而Y2中Planctomycetes的相对丰度为3.92%，其中检测到大量的Anammox功能菌，主要以CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia两种属为主导功能菌属，分别占总细菌的2.48%和0.84%，anammox功能菌的丰度大量增高与反应器呈现很好的Anammox性状相符合。