一株具有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌的筛选、鉴定及生物学特性研究

蒋凯丽， 周新丽*， 高海燕

1.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093;2.上海大学生命科学学院，上海 200444

樱桃番茄又被称为圣女果、小西红柿，为多汁浆果，具有果皮薄、怕挤压、呼吸作用强和富含糖分等特点，极易受真菌感染，耐贮性差，因此樱桃番茄的采后保鲜一直是影响果农收入的主要问题。樱桃番茄果实的采后病害[1,2]主要有灰霉病、炭疽病、根霉果腐病等，对于樱桃番茄病害的防治，目前仍已化学杀菌剂为主，然而长期使用化学试剂不仅会诱导果蔬的耐受性，还会对食品安全和生态环境造成一系列负面影响。

研究发现[3]自然界中存在一些微生物，能够有效抑制果实表面菌丝生长，防止由于病原菌侵染导致的果蔬采后腐烂，实现采后保鲜，即生物防控。如一些荧光假单胞菌菌株[4]可以有效控制番茄灰霉病，枯草芽孢杆菌菌株[5-7]能够有效地控制柑橘的青霉病、樱桃的褐腐病，解淀粉芽孢杆菌[8-10]可以抑制西瓜专化型尖孢镰刀菌、石榴枯萎病等，这种方法不仅能防御采后病害，而且不会对环境造成污染。但是目前生物防控在实际应用中仍存在许多问题，包括在商业条件下效果的不一致性、对波动的环境条件的有限耐受性以及耐储存制剂生产困难，因此国内外学者致力于研究高效、稳定和具有广谱抑菌性的生物防治细菌。

从果实、植物根部、土壤等[11,12]分离出的生物防治细菌比其他来源更安全，本文拟通过平板对峙试验，从樱桃番茄成熟红果上分离筛选对其采后病原菌有抑制作用的生物防治细菌，并对其形态特征、生理生化特性、生物学特性进行研究，以期为进一步研究开发高效稳定安全的生防治剂、解决果蔬采后腐烂变质的病害控制提供理论依据，为果蔬采后保鲜工作做出贡献。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

病原真菌：极细链格孢菌(Alternariatenuissima)，黑曲霉(Aureobasidiummelanogenum)，青霉菌(Penicilliumoxalicum)，尖侧多隔孢霉(Pleurophragmiumacutum)，拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis)，盐生枝孢霉(Cladosporiumhalotolerans)，子囊菌(Ascomycota)，胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)均由上海大学生命科学学院食品质量与安全控制实验室筛选分离自樱桃番茄并保存。

试剂：牛肉浸膏、酵母浸膏、氯化钠、鱼粉蛋白胨、葡萄糖和琼脂均购于上海国药集团化学试剂有限公司，HBI芽孢杆菌生化鉴定条购于青岛海博生物技术有限公司，马铃薯购自菜市场。

1.2 仪器与设备

YP5001 电子天平，上海菁海仪器有限公司；立式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；HH-B11-600-S-II 电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；DHZ-DA 大容量全温振荡器，太仓市实验设备厂；超净工作台，苏州净化设备有限公司；PB-10 pH计，北京赛多利斯科学仪器有限公司；台式离心机，上海安亭科学仪器厂；紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；C1000Touch PCR仪，上海伯乐生命医学产品有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1培养基制备

牛肉膏蛋白胨液体培养基(LB)：牛肉浸膏5 g，酵母浸膏5 g，氯化钠5 g，鱼粉蛋白胨10 g，自来水定容至1 000 mL，pH调整为7.0～7.2，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，用于拮抗细菌的培养。LB固体培养基在LB液体培养基的基础上再加琼脂粉18 g。

葡萄糖马铃薯固体培养基(PDA)：200克马铃薯去皮切成小块后置于600 mL蒸馏水中煮沸20 min，8层纱布过滤后取其上清液，加入20 g葡萄糖、20 g琼脂，等待其溶解后用自来水定容至1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.3.2拮抗细菌KL-1分离、纯化

根据五点取样方法，在上海跃科蔬菜原种场取樱桃番茄成熟红果，每份样品分别称取10 g，加入90 mL LB液体培养基的锥形瓶中，37 ℃下150 r/min转速震荡48 h，然后用无菌移液器吸取1ml菌液，用灭菌蒸馏水浓度梯度稀释成10-1至10-7的浓度，将10-5、10-6和10-7浓度的菌液分别取0.1 mL涂布倒于LB培养基平板上。每个稀释度重复三次，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，24 h后将每个平板上的单菌落划线到其他新鲜平板上以进行菌种的纯化。

1.3.3拮抗细菌KL-1的筛选[13-15]

初筛：取极细链格孢菌病原菌菌块置于PDA平板中央，在距离病原菌菌块2 cm两侧点接纯化的待筛选细菌，在37 ℃恒温培养箱中培养4 d，观察两个菌落生长情况，是否有抑菌圈产生，筛选出对病原菌表现抑制的菌株。

复筛：取八种病原菌菌块置于PDA平板中央，用接种环挑取有抑菌效果的细菌点接在距平板中央3 cm处的4个角点上，放入培养箱28 ℃恒温培养4 d，每组处理做三个平行，试验重复两次。以只接种病原菌的PDA平板培养基作对照，观察病原菌的生长状态，测量病原菌菌落直径，计算菌株的抑制率。

1.3.4菌株KL-1的鉴定[16,17]

1.3.4.1KL-1形态特征鉴定

将待测菌株在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，37 ℃培养12 h，观察菌落的颜色、形态、透明度等特征，并通过使用光学显微镜和革兰氏染色观察细胞形态。

1.3.4.2KL-1生理生化特性鉴定

V-P试验、柠檬酸盐利用、丙酸盐利用、D-木糖利用、L-阿拉伯糖利用、D-甘露醇利用、明胶液化试验、7%NaCl生长、pH 5.7生长、硝酸盐还原、淀粉水解、厌氧性测定，每个处理三次重复。

1.3.4.3KL-1分子生物学鉴定

对KL-1进行16S rDNA鉴定，将菌种接种在LB液体培养基中，于37 ℃ 150 r/min摇床中培养12 h，然后用生工公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取菌株的DNA。PCR扩增：使用细菌16S rDNA基因通用引物，上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′，下游引物1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。PCR扩增采用50 μL反应体系，其中：10×PCR buffer 5 μL；dNTP 4 μL；引物各1 μL；TaqDNA酶0.4 μL；模板2 μL；用ddH2O补足到50 μL。PCR扩增的反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，进行35个循环，最后在72 ℃保温10 min。将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，利用NCBI数据库中的BLAST工具对序列进行同源性分析，建立系统发育树。

1.3.5菌株KL-1的生物学特性研究[18,19]

1.3.5.1种子培养液的制备

将在LB固体培养基上预先活化的KL-1接入灭菌后的LB液体培养基中，在37 ℃、150 r/min培养 24 h，用无菌蒸馏水将浓度调至1×108CFU/L，即为KL-1种子培养液。

1.3.5.2生长曲线的测定

接种1 mL KL-1种子培养液到100 mL LB液体培养基中，放置于37 ℃，150 r/min 的摇床中培养。取菌体培养液5 mL，每隔3h用分光光度计在600 nm 波长下测吸光度，观察曲线情况，至少测至48 h。以不接菌的LB液体培养基为空白对照，校正零点，每处理3个重复。

1.3.5.3最适生长pH的测定

配制LB 液体培养基，用NaOH分别调成100 mL pH为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，灭菌后分别接种1 mL KL-1种子培养液于100 mL调至不同pH的LB液体培养基中，于37 ℃，150 r/min的摇床中培养，48h后用紫外可见分光光度计在 600 nm 波长下测其吸光度。以不接菌的LB液体培养基为空白对照，每处理3个重复。

1.3.5.4最适生长温度的测定

接种1 mL KL-1种子培养液于100 mL pH 为 7.0 的 LB 液体培养基中，于 20 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃，150 r/min 的摇床中培养，48 h后用分光光度计在600 nm波长下测其吸光度。以不接菌的LB液体培养基为空白对照，每处理3个重复。

1.4 数据处理

数据分析用SPSS 19.0软件进行，实验均设三次重复，结果表达采用平均值±标准误差，运用Origin 2019b进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 菌株KL-1的筛选

以樱桃番茄成熟红果为样本，樱桃番茄最常见的病原真菌极细链格孢菌为指示菌，通过平板拮抗试验，从樱桃番茄成熟红果上筛选得到一株抑菌效果明显的拮抗细菌，将其命名为KL-1。再对其进行复筛，结果见图1。从图中可看出，拮抗细菌KL-1对于七种病原菌：极细链格孢菌、黑曲霉、青霉菌、拟康宁木霉、盐生枝孢霉、子囊菌和胶孢炭疽菌都有明显的抑制作用，其中KL-1对黑曲霉的抑制率最大为81%，对其他六种病原菌抑制率也均高于70%，对尖侧多隔孢霉的抑制率为0，说明菌株KL-1具有广谱抑菌性，可以抑制番茄中的多种病原真菌。

图1 KL-1对病原菌的抑制率

2.2 菌株KL-1的鉴定

2.2.1形态学鉴定

菌株KL-1在LB固体培养基上37 ℃培养12 h后，菌落形态呈规则圆形，边缘整齐，淡黄色无光泽，不透明(图2)。光学显微镜(×100油镜)下观察，菌体细胞呈短杆状，革兰氏染色呈阳性(图3)。

2.2.2生理生化鉴定

如表1所示，KL-1菌株V-P试验呈阳性反应，不能利用柠檬酸盐、丙酸盐，能利用D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇，能液化明胶，在7%NaCI不可以生长，pH 5.7可以生长，硝酸盐还原呈阳性反应，能水解淀粉，无法在厌氧条件下生长。根据《常见细菌系统鉴定手册》中有关芽孢杆菌种属鉴别特征的描述，初步推测该菌为芽孢杆菌属，具体种还需要进一步鉴定。

图2 KL-1在LB固体培养基平板培养12 h后的菌落形态

图3 光学显微镜下KL-1的菌体形态

表1 KL-1生理生化特性

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

2.2.3分子生物学鉴定

扩增出拮抗细菌KL-1的16S rDNA片段序列全长为1 483 bp，在GenBank数据库中进行Blast同源性分析，结果表明KL-1菌株与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的部分序列同源性达 99%以上。随后利用 MEGA 7.0软件构建出系统进化树(图4)，结果显示 KL-1与解淀粉芽孢杆菌(KY357304.1)的遗传距离最近，再一次证实生防菌KL-1属于解淀粉芽孢杆菌。综合以上各项实验结果，可以鉴定KL-1为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

2.3 菌株KL-1的生物学特性研究

2.3.1KL-1生长曲线

图5为在600 nm波长下，经过不同培养时间后KL-1培养液的吸光度。从图5可看出，KL-1在LB液体培养基中，当培养时间为18 h时，培养液的吸光度值最大。KL-1在接种到LB培养液后的9 h内处于对数生长期，9 h～21 h内处于稳定生长期，接种21 h后进入衰老期。可见该菌生长速度较快，接种后9 h～21 h内菌量最多。

图4 KL-1的系统进化树

图5 KL-1生长曲线

2.3.2pH对KL-1生长的影响

图6为在600 nm波长下，处于不同pH条件下培养24 h后KL-1培养液的吸光度。从图6可看出，该菌在较大pH范围内都能生长，但pH对KL-1菌株生长影响明显。其中pH在5～9范围内适宜KL-1的生长，而KL-1最适pH在7.0左右，可见该菌适宜在中性条件下生长。

图6 pH对KL-1生长的影响

2.3.3温度对KL-1生长的影响

图7为在600 nm波长下，处于不同温度条件下培养24 h后KL-1培养液的吸光度。从图7可看出，温度对菌株KL-1生长和繁殖有明显的影响，在20 ℃～50 ℃范围内，KL-1生长和繁殖速率呈先上升后下降趋势，最适温度为37 ℃左右。

图7 温度对KL-1生长的影响

3 讨论与结论

国内外报道了很多有关生防菌防治番茄采后病害的研究，包括酵母菌等真菌类和芽孢杆菌等细菌类[20,21]。真菌类如酵母菌L-1-6[22]对番茄早疫病的抑制效果为77.8%，酵母菌BS-316[23]对番茄灰霉病的抑制效果为84.92%，；细菌类如放线菌FX-03[24]对番茄早疫病的抑制效果为75.6%，白黑链霉菌T22[25]对番茄灰霉病的抑制效果为55.1%，芽孢杆菌W12和W118[26]对番茄青枯病的抑制效果为62.3%。已报道的这些生防菌均探究了对番茄采后常见某一种病原菌的抑制效果。

本研究从樱桃番茄成熟红果上分离的菌株KL-1 的抑菌范围比较广泛，可以同时抑制极细链格孢菌、黑曲霉、青霉菌、拟康宁木霉、盐生枝孢霉、子囊菌和胶孢炭疽菌这七种番茄采后常见病原菌；其抑菌率较高，其中对黑曲霉的抑制率最大为81%，其他六种病原菌抑制率也均高于70%。通过观察菌株形态特征、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析对其进行分子生物学鉴定，确定该菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，生长曲线表明在培养9 h内生长最旺盛，最适生长pH为7.0，最适生长温度为37 ℃。该拮抗菌株在体外实验中表现出很好的抑菌效果，但其如何发挥抑菌作用，是否在番茄果实上也能表现出显著的抑菌效果，还需进一步研究证实。