沉默膜联蛋白A2对口腔细胞癌KB细胞迁移侵袭能力的影响

麻颖宜，王海业

口腔鳞状细胞癌是一种常见的口腔恶性肿瘤，目前其发病率在世界恶性肿瘤中排名第六［1］。在世界范围内每年约30万人患口腔癌，五年存活率仅50%［2］。近些年尝试了放射治疗和化学药物的联合，但治疗效果仍不乐观［3］。因此，口腔鳞状细胞癌的治疗需要新的药物和靶点。膜联蛋白A2（Annexin A2）是膜联蛋白家族极为重要的成员之一，大量研究结果表明AA2的异常表达和分布与肿瘤的转移和浸润关系密切，它可与浸润转移中的关键作用分子相互作用从而促进癌细胞的转移［4］但目前关于AA2作用于口腔细胞癌的研究报道较少。该研究通过沉默膜联蛋白AA2基因的表达，分析AA2表达对KB细胞浸润及迁移的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂人口腔上皮癌细胞KB细胞购自 Solarbio； 货号：SCC-110811；ExFect2000 Transfection Reagent、反转录试剂盒HiScript II Q RT SuperMix for qPCR、定量PCR试剂盒为ChamQTMSYBR Color Qpcr Master Mix均购自南京诺唯赞生物公司。siRNA及阴性对照质粒由上海吉玛生物科技公司设计并包装。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与转染 细胞癌KB细胞在含10%胎牛血清1×105IU/L青链霉素的MEM培养基上，于5%CO2、37℃的培养箱中培养。取生长良好的对数生长期细胞进行以下实验。该实验分为三组：空白对照组（NC组）、阴性对照组（siNC组）、干扰组（siAA2组）。取对数期细胞胰酶消化后计数铺板，2×105/well，接种96孔板，每组设6个复孔；静置培养过夜，待细胞融合度达到60%左右时进行转染。分别转染siRNA NC和Annexin A2-siRNA至阴性对照组和干扰组。转染72 h后收样运用试剂盒进行RT-qPCR检测。

1.2.2 RT-qPCR检测沉默Annexin A基因结果Trizol-离心柱法提取组织总RNA。取2 μl RNA溶液于Merinton SMA4000检测，并计算RNA溶液浓度，判断 RNA 提取质量：A260/A280＞2．0 且＜2．3，则可以满足后续RT-qPCR所需。再进行AA2基因的荧光定量PCR检测。PCR引物设计如下：Annexin A2 上游：5’ACCTGGAGACGGTGATTT， 下游：5’-TGCTCTTCTACCCTTTGC-3’。 β-actin 上 游 ：5’-GGAAATCGTGCGTGAC-3’， 下游：5’-ATGCCCA GGAAGGAA-3’。 qPCR 反应体系为 20 μl：PCR 上下游引物各 2 μl， 去离子水 4 μl，DNA 模板 2 μl。PCR 反应条件：95．0 ℃预变性 10 min，95．0 ℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 20 s，40 个循环。 95℃ 10 s，60 ℃1 min，每增加0．5℃采集5次荧光，一直达到95℃，40℃30 s，采用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达变化，实验重复3次。

1.3 Transwell实验取以上各组细胞。用0．25%Typsin+0．02%EDTA 消化，离心，计数，用 2%FBS+1×P．S．MEM 培养基重悬，稀释成 2．5×105个/ml，铺Transwell小室的上室，下室加入 500 μl的 10%FBS+1×P．S MEM 培养基；16 h 后，PBS 清洗，用 4%多聚甲醛室温固定15 min；PBS清洗，加入结晶紫染色15 min，PBS清洗；置于室温下风干，显微镜下拍照（200×）。

1.4 细胞划痕实验细胞实验同1．2，转染6 h后换液，取对数生长期细胞接于24孔板中，每组6个孔。培养 （细胞密度为1×106个/孔），细胞融合至80%加入无血清培养液培养24 h，用200 μl的枪头垂直于培养板划线，用PBS洗去细胞碎片。每孔中加入含有10%血清的DMEM培养基进行培养。分别于0和24 h、48 h后于倒置显微镜下观察划痕区域的愈合情况并拍照。通过ImageJ软件来计算愈合面积：（0 h初始划痕宽度-现划痕宽度）/初始划痕宽度×100%；比较各组细胞的迁移情况。实验重复3次取平均值。

1.5 统计学方法采用SPSS 19．0进行数据统计分析，计量资料用s）表示，组间数据比较用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 沉默蛋白A2的效果检验PCR检测结果发现与NC组和siNC组相比，siAA2组的KB细胞中AA2mRNA水平显著低于对照组和NC组 （P＜0．05），提示转染成功沉默了AA2的表达。见表1。

表1 三组KB细胞内AA2的表达量

2.2 沉默AA2对各组细胞迁移的影响Transwell实验中发现，与NC组和siNC组相比，siAA2组中细胞穿膜数量较少，与两组相比都具有显著性差异（P＜0．05，图 1、2）。

图1见封三。

下图1：麻颖宜，王海业.沉默膜联蛋白A2对口腔细胞癌KB细胞迁移侵袭能力的影响（正文148～150，167页）

图1 沉默AA2后三组细胞穿膜细胞镜下图（×200）

图2 沉默AA2后三组细胞穿膜细胞数量比较图

2.3 细胞划痕实验细胞细胞划痕实验检测沉默A2基因后细胞迁移能力的变化。结果显示划痕24 h和48 h后siAA2组中细胞愈合面积相对于NC组和siNC相比明显较少且具有统计学意义 （P＜0．05），说明AA2基因的沉默能有效抑制KB细胞的迁移，对肿瘤细胞的增殖起到重要的作用。见图3、表2。

图3 各组KB细胞在细胞划痕后不同时间不同组别间愈合面积情况（×200）

表2 沉默AA2基因后各组细胞划痕后愈合面积比较±s，%）

表2 沉默AA2基因后各组细胞划痕后愈合面积比较±s，%）

注：与 NC 组比较，＊P＜0．05；与 siNC 组比较，#P＜0．05。

组别 0 h 24 h 48 h NC 0 52±5 90±4 siNC 0 51±6 89±3 siAA2 0 43±6＊# 78±4＊#F 值 - 4．550 19．463 P 值 - 0．029 0．000

3 讨论

口腔癌是我国常见的口腔恶性肿瘤之一，严重危害患者的身心健康［5］。肿瘤的远处转移是患者预后差和生存率低的主要原因之一，但肿瘤细胞的侵袭和转移是一个多因素复杂的过程，其机制尚不完全明确［6］，该过程的相关蛋白和特异性分子仍需要进一步深入研究。

AA2基因过表达可促进恶性肿瘤的进展，与肿瘤的浸润和迁移有着密切的关系。经研究发现，膜联蛋白A2基因的过表达可使子宫内膜癌、结直肠癌、肾癌进一步恶性发展［7］。另有研究显示，AA2基因在肿瘤中尤其是高发性肿瘤中存在过表达［8］。有研究证明，对2321例患者14种肿瘤的Meta分析结果表明AA2基因的表达与患者的预后呈正相关［9］。也有学者通过一系列实验表明，AA2可能与口腔鳞癌细胞的分型、癌灶体积、分期以及淋巴结转移浸润有关［10］。该研究选用高转移性口腔细胞癌KB细胞，用siRNA技术沉默膜联蛋白A2的表达，研究Si-A2基因沉默后对口腔癌细胞KB迁移和侵袭的影响。结果显示，siRNA转染沉默AA2基因后，其mRNA水平显著降低，提示AA2基因干扰成功；后续实验结果表明，siAA2组细胞的穿膜数与对照组相比显著减少，提示KB细胞中AA2基因的沉默可有效抑制细胞的浸润侵袭能力。细胞划痕实验中细胞培养24 h及48 h时Si-AA2组细胞的愈合面积最小相对于对照组具有显著性差异，进一步说明沉默AA2基因可减弱口腔细胞癌KB细胞迁移能力。与现有研究结论基本一致。纤维蛋白溶酶可激活基质金属蛋白酶（MMPs）尤其是MMP-1活化从而导致膜蛋白的水解和细胞外基质的降解等，进而导致血管外周基膜降解，造成肿瘤细胞的迁移［11］。有研究表明AA2蛋白经过一系列反应可生成PL，所以推测AA2有可能通过此途径影响肿瘤细胞的迁移侵袭能力［12，13］。但这一机制是否也发生在口腔鳞状细胞癌中仍需要进一步实验证实。

综上所述，该研究认为沉默AA2蛋白可有效抑制口腔细胞癌KB细胞的生殖迁移和侵袭能力，为临床口腔细胞癌治疗靶标的新思路奠定一定基础。但目前本研究未对该过程机制进行阐明，还需后续实验进行验证及深入研究，以探讨AA2调控口腔细胞癌KB细胞的迁移和侵袭的机制。