乳腺非特殊型浸润性癌组织中CD34和Ki67的表达及相关性＊

徐宪伟，徐小艳，王 娜，姜 黄，滑洋洋，杨金花

乳腺非特殊型浸润性癌，旧版WHO中称为浸润性导管癌，是乳腺癌最常见的类型，在公开发表的文献统计病例中占40%～70%，且预后较差。CD34是血管的特异性标志物，存在于微血管的内皮细胞，能通过抗体与血管内皮细胞结合，促进血管内皮的分裂和毛细血管的出芽生长，促进新血管的生成，可直接反映微血管的生成情况。Ki67是一个标记细胞增殖状况的常用指标，尤其经常用于反映恶性肿瘤细胞的增殖状况。既往在乳腺非特殊型浸润性癌的研究中，CD34和Ki67表达的相关性少见报道，因此笔者采用免疫组织化学方法检测乳腺非特殊型浸润性癌组织中CD34和Ki67的表达，并分析两者之间的相关性及其与临床病理特征之间的关系，以期为乳腺非特殊型浸润性癌发病机制提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料收集郑州人民医院2018年1月—2018年12月的病理活检标本原发非特殊型浸润性癌97例，均为女性患者，术前均未接受放疗、化疗、生物治疗等辅助治疗，收集临床资料，按2012版WHO乳腺癌组织病理分级分类法进行TNM分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期56例，Ⅲ期20例；肿块最大径≤2 cm者35例，＞2 cm且≤5 cm者 57例，＞5 cm者5例：伴有腋窝淋巴结转移者45例，无淋巴结转移者52例，组织学分级Ⅰ级8例，Ⅱ级68例，Ⅲ级21例，相应的癌旁正常乳腺组织为对照组。所有病例均经过两位中级及以上病理医师复诊证实。

1.2 方法新鲜切除的乳腺组织标本，均采用北京益利精细化学品有限公司的10%中性缓冲甲醛固定液进行固定，常规脱水，石蜡包埋，3 μm连续切片进行HE及免疫组化染色。采用Leica公司的BOND-MAX免疫组化机进行免疫组织化学染色，其中一抗试剂为福州迈新生物技术开发有限公司鼠抗人CD34、鼠抗人Ki67单克隆即用型试剂，二抗试剂均为英国Leica Biosystems Newcastle Ltd公司产品。主要步骤如下：（1）石蜡组织切片、烤片、脱蜡并水化；（2）EDTA 修复 20 min；（3）过氧化酶封闭剂 5min；（4）一抗孵育 15 min；（5）一抗后试剂 8 min；（6）多聚物 8 min；（7）DAB 显色 10 min；（8）苏木素复染 5 min；（9）脱水、透明和封片。

1.3 结果判读Ki67染色结果采用相对定量法：乳腺非特殊型浸润性癌以Ki67阳性的癌细胞数占癌细胞总数的百分比作为标记指数，方法：随机观察5个高倍视野（×200倍），以每个视野下“Ki67阳性肿瘤细胞数/肿瘤细胞总数”×100%的平均数作为Ki67标记指数；乳腺良性导管上皮增生以Ki67阳性增生导管上皮细胞数占增生导管上皮细胞总数的百分比作为Ki67的标记指数。MVD（microvessel density）计数采用Chalkley记数法，由两位事先不知道临床资料的病理医师在低倍光镜视野下扫视整个切片寻找3个CD34染色阳性的脉管高密度集中的区域作为“热点”（hot spots），然后在 200倍光镜视野下计数微脉管的数目，但应忽略管腔直径＞8个红细胞或管壁有平滑肌存在的脉管。取3个视野的微脉管数的平均值作为该标本的MVD。两位医师计数差异10%以上者重新计数。

1.4 统计学方法采用SPSS 17．0软件进行统计学分析。组间计量资料均数比较采用t检验和方差分析，如果方差齐，采用LSD检验，如果方差不齐，采用Dunnett’s T3检验。相关性分析采用Spearman相关分析。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果CD34定位于内皮细胞膜和（或）胞质，呈颗粒状，在癌组织中均有不同程度的表达，并且分布不均，在癌组织边缘呈高表达，在较大血管中也有表达。乳腺非特殊型浸润性癌MVD（48．20±21．02）高于良性对照组（8．75±4．82），有显著性差异（P＜0．05）；Ki67 定位于细胞核，染色呈棕黄色，其在普通型增生的乳腺导管上皮上不表达或有少量的表达，其在乳腺非特殊型浸润性癌细胞有较高的表达，其中乳腺非特殊型浸润性癌Ki67标记指数（37．88±27．10）高于良性对照组 Ki67 标记指数（2．80±1．85），有显著性差异（P＜0．05），见图 1。

图1见封三。

下图1：徐宪伟，徐小艳，王 娜，等.乳腺非特殊型浸润性癌组织中CD34和Ki67的表达及相关性＊（正文144～147页）

图1 MVD和Ki67在乳腺非特殊类型浸润性癌中的表达（免疫组织化学，200×）

2.2 MVD和Ki67分别与乳腺非特殊型浸润性癌患者临床病理特征的关系97例乳腺非特殊型浸润性癌中，MVD与肿瘤的直径、组织学分级及pTNM 分期有关（P＜0．05）。 MVD 在肿瘤最大直径≤2 cm、 ＞2≤5 cm、 ＞5 cm 组 中 分 别 为 30．71±6．55，54．91±17．26，94．00±11．40， 整体比较差异具有统计学意义（F=59．866，P=0．000），其中两两比较均有统计学意义（P均=0．000）；MVD 在组织学分级Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级表达依次升高，分别为32．22±8．33，47．28±20．18，58．50±23．06， 整体比较差异具有统计学意义（F=5．547，P=0．005），其中Ⅰ级与Ⅱ级比较差异有统计学意义（P=0．001），Ⅰ级与Ⅲ级比较差异有统计学意义（P=0．000），Ⅱ级与Ⅲ级比较差异无统计学意义（P=0．164）；MVD 在 pTNM 分期Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期中表达依次升高， 分别为 30．24±6．80、48．48±17．53、66．25±24．38， 整体比较差异均具有统计学意义（F=21．464，P=0．000），其中两两比较均有统计学意义（P 均=0．000）；MVD 与患者年龄、肿瘤部位及淋巴结转移均无关（P＞0．05）。

Ki67与肿瘤的直径、组织学分级及pTNM分期有关（P＜0．05）。 Ki67 阳性指数在肿瘤最大直径≤2 cm、＞2≤5 cm、＞5 cm 组中分别为 26．60±22．95，44．53±27．70，41．00±25．59， 整体比较差异具有统计学意义（F=5．196，P=0．007），其中≤2 cm 与＞2≤5 cm比较差异有统计学意义（P=0．004），≤2 cm 与＞5 cm比较差异无统计学意义（P=0．591），＞2≤5 cm 与＞5 cm比较差异无统计学意义（P=0．986）；Ki67阳性指数在组织学分级Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级表达依次升高，分别为 11．67±7．91，36．97±26．65，52．75±24．89，整体比较差异具有统计学意义（F=8．374，P=0．000），其中Ⅰ级与Ⅱ级比较 P=0．006， Ⅰ级与Ⅲ级比较 P=0．000，Ⅱ级与Ⅲ级比较P=0．016，差异均具有统计学意义；Ki67阳性指数在 pTNM分期中分别为 21．00±19．95，42．11±28．90，43．75±21．70，整体比较差异有统计学意义（F=5．739，P=0．004），其中 Ki67 阳性指数在pTNMⅠ期和Ⅱ期比较差异有统计学意义 （P=0．002），Ⅰ期和Ⅲ期比较差异有统计学意义 （P=0．006），Ⅱ期和Ⅲ期比较差异无统计学意义 （P=0．808）。Ki67与患者年龄、肿瘤部位及淋巴结转移均无关（P＞0．05）。 见表 1。

表1 乳腺非特殊类型浸润性癌中MVD和Ki67与临床病理参数特征的关系（x±s）

2.3 MVD和Ki67蛋白相关性分析对CD34和Ki67在乳腺非特殊型浸润性癌中的表达分别进行Spearman相关分析，二者呈正相关，即MVD值越大，Ki67 指数越高（r=0．632，P=0．000）。

3 讨论

CD34于1986年被发现，为单链高度糖基化型跨膜蛋白，存在于微血管的内皮细胞，它能通过抗体与相应的血管内皮细胞结合，增加内皮细胞的化学趋向性，促进血管内皮的分裂和毛细血管出芽生长，诱导蛋白溶解酶生成，有利于内皮细胞穿过基质，促进新生血管形成。因此，CD34被认为是血管特异的标志物［1］，可直接反映微血管的生成情况。通过该实验发现乳腺非特殊型浸润性癌组织中微血管密度明显高于乳腺良性病变组织，提示癌组织有明显的血管新生，在癌巢周边及浸润前缘血管新生更加明显。微血管密度在肿瘤大小、组织学分级及pTNM分期分组中的差异有统计学意义。研究结果表明原发肿瘤越大、组织学分级越高、pTNM分期越晚的乳腺癌微血管形成越多。甄乐锋［2］、徐小艳［3］等研究认为CD34与肿瘤大小，组织学分级、淋巴结转移及pTNM分期有关，与该结果基本相似，但在淋巴结转移相关性存在不一致性，该实验CD34的表达中，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，但差异无统计学意义，可能跟样本含量有关。

Ki67是一种在增殖细胞核基质内表达的核蛋白，定位于第10号染色体上，于1983年由Gerdes等发现［4］。它的功能和细胞有丝分裂有关，与肿瘤细胞的周期性变化密切相关。由于其半衰期短，Ki67抗原在细胞分裂晚期很快消失，脱离细胞周期后迅速降解，被认为能够比较理想的反映细胞增殖活性，是目前评估肿瘤细胞增殖活性、判断肿瘤侵袭力和肿瘤预后的最可靠的指标［5-8］。该实验中乳腺非特殊型浸润性癌Ki67标记指数明显高于良性对照组Ki67标记指数，同时Ki67阳性表达与肿瘤大小、组织学分级及pTNM分期呈正相关。既往文献报道Ki67在乳腺癌中的表达与临床病理特征关系的研究中，阎晓路［9］、夏红强［10］等认为 Ki67 的表达与pTNM分期、肿瘤大小、组织学分级及淋巴结转移有关，而李宝江［11］、连婧［12］则认为与淋巴结转移和肿瘤大小无关。Ahmed等［13］研究结果表明Ki67可以判断乳腺癌独立预后因子，但是与肿瘤直径和淋巴结转移状况无关。

CD34 和 Ki67 的相关性在肝癌［14］、胃癌［15］等肿瘤中均有研究报道，且研究显示二者呈正相关。以往有关乳腺癌CD34和Ki67的研究中，二者单独研究较常见，而相关性的研究尚未见同类报道。该文相关分析结果研究表明乳腺非特殊型浸润性癌中CD34和Ki67的表达呈明显正相关，并与乳腺非特殊型浸润性癌的病理分期关系密切，结果提示两者在乳腺非特殊型浸润性癌的进展中发挥着重要作用，笔者认为在乳腺非特殊型浸润性癌的发展中CD34的高表达提示更多新生血管的形成，为癌细胞的复制增殖提供了更多的营养物质，促进了Ki67的高表达，更多的癌细胞生成加快了癌组织的生长和转移。选择对CD34抑制剂的开发使用有望成为抑制乳腺非特殊型浸润性癌生长和转移的有效途径，该文仅用免疫组化得出上述推测证据尚不充分，其具体机制有待后续深入研究。

综上所述，CD34和Ki67在乳腺非特殊型浸润性癌中均与肿瘤大小、组织学分级、pTNM有关，二者表达呈正相关，对二者表达规律及相关性的研究将进一步拓展了人们对乳腺非特殊型浸润性癌发病机制的认识。