槐定碱微球制备工艺研究

胡 扬，薛 昊，王金宏，王 昊，徐蓓蕾，孙丽鹏，杨 波

(哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨150076)

槐定碱(Sophoridine, SR)是从豆科槐属植物苦豆子、山豆根中得到四环类喹诺里西啶类生物碱[1]，是由我国科研人员自主研发的一种新型广谱抗癌药[2]，可以抑制多种动物移植的肿瘤[3-5]，对人类白血病细胞株、表皮癌株也有一定的抑制作用.

随着研究的不断深入，槐定碱更多的药理作用陆续被发现，新技术和新剂型的研究也相应增加.目前已上市的仅有盐酸槐定碱注射液，作为广谱抗癌药，具有一定副作用，并且临床试验表明该药在人体内分布广，半衰期短，消除较快.因此如何将槐定碱制成缓释制剂给药，既能提高槐定碱在体内的靶向分布，延长半衰期，又可避免原注射剂对人体所引起的副作用，已成为研究人员关注的重点.

课题组前期实验完成了槐定碱微球体外分析方法的建立.本文通过单因素考察实验和正交实验确定了槐定碱微球的处方和制备工艺，以期待在后续研究中利用微球的靶向性和缓释性能，对特定的器官进行靶向治疗.

1 实验材料

1.1 药物与试剂

槐定碱(质量分数>98%，西安天瑞生物技术有限公司)；槐定碱对照品(质量分数>98%，上海源叶生物科技有限公司)；壳聚糖(脱乙酰度≥95%，黏度100～200 mPa·s，上海阿拉丁生化科技股份有限公司).

司盘80(分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂)；吐温80(分析纯，天津市光复精细化工研究所)；戊二醛50%(分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司)；异丙醇(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；三乙胺(分析纯，天津市光复精细化工研究所)；甲醇(色谱纯，默克股份两合公司，德国)；乙腈(色谱纯，默克股份两合公司，德国).

1.2 仪器

Waters 1525高效液相色谱仪(美国Waters公司)；UV-5200PC紫外/可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；AXTGL18M安信离心机(盐城市安信实验仪器有限公司)；LE204E102电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；FE28型pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司)

2 实验方法

2.1 制备方法

通过查阅文献[6-11]和预试验结果，确定微球的制备方法为乳化交联法，制备工艺如下：精密量取一定量的液体石蜡、乳化剂司盘-80置于烧杯中，作为油相用磁力搅拌器混合均匀.另称取壳聚糖置于烧杯中，用稀释的醋酸溶解后，静置脱气，取槐定碱原料药溶于水中，与壳聚糖溶液混合，用磁力搅拌器将其混合均匀，作为水相.磁力搅拌器升温至一定温度后，将水相缓慢滴入油相内，乳化，一段时间后加入戊二醛进行固化，继续搅拌直至微球形成.静置，将上清液倒出，用石油醚和丙酮洗涤、抽滤，将上清液和洗涤液合并得到合并液，洗涤后部分干燥得到微球.

2.2 槐定碱微球体外分析方法

采用Waters1525高效液相色谱仪进行槐定碱含量测定.色谱条件如下：色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.05 mol/L磷酸二氢钾(含0.2 mL/L三乙胺)溶液-乙腈(90∶10)；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：208 nm.

2.3 包封率和载药量的测定

精密量取一定量的微球，研磨，加入适量甲醇，震荡摇匀，定容，超声60 min，涡旋1 min.12 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，进样10 μL测定峰面积，计算样品中含槐定碱的量，按公式算出微球的载药量和包封率.

2.4 单因素筛选实验

1)壳聚糖用量的选择

按照“2.1项”下方法，乳化剂为司盘-80，用量为0.54 g，油水比例为3∶1，交联时间3 h，药物用量0.04 g，其他条件均相同，考察不同用量的壳聚糖对微球的影响.

2)固化温度的选择

按照“2.1项”下方法，油水比3∶1，乳化剂为司盘-80，用量为0.54 g，壳聚糖用量0.05 g，药物用量0.04 g，交联时间3 h，其他条件均相同，考察固化温度对微球的影响.

3)油水比例的选择

按照“2.1项”下方法，乳化剂为司盘-80，用量为0.54 g，壳聚糖用量0.05 g，药物用量0.04 g，交联时间3 h，其他条件均相同，考察油水比对微球的影响.

4)交联剂用量的选择

按照“2.1项”下方法，油水比3∶1，乳化剂为司盘-80，用量为0.54 g，药物用量0.04 g，壳聚糖用量0.05 g，交联时间3 h，其他条件均相同，考察交联剂用量对微球的影响.

5)交联剂固化时间的选择

按照“2.1项”下方法，油水比3∶1，乳化剂为司盘-80，用量为0.54 g，壳聚糖用量0.05 g，药物用量0.04 g，其他条件均相同，考察交联时间对微球的影响.

6)药物用量的选泽

按照“2.1项”下方法，油水比3∶1，乳化剂为司盘-80，用量为0.54 g，壳聚糖用量0.05 g，交联时间3 h，其他条件均相同，考察槐定碱用量对微球的影响.

7)乳化剂用量的选择

按照“2.1项”下方法，油水比3∶1，壳聚糖用量0.05 g，交联时间3 h，药物用量0.04 g，其他条件均相同，考察药物乳化剂司盘-80用量对微球的影响.

2.5 正交设计优化制备工艺

在预实验以及单因素考察实验结果的基础上，选择交联时间(A)、乳化剂用量(B)、壳聚糖用量(C)为三个因素，以槐定碱微球的载药量、包封率和粒径为指标，按照 L9(34)表进行正交实验.

2.6 验证实验

采用最终确定的制备工艺制备3批槐定碱微球，进行平行实验验证.

3 实验结果与分析

3.1 单因素筛选实验结果

1)壳聚糖用量的选择

结果见表1，选择壳聚糖用量为75 mg.

表1 壳聚糖用量的筛选结果(n=3)

2)固化温度的选择

结果见表2，选择固化温度为40 ℃.

表2 温度的筛选结果(n=3)

3)油水比例的选择

结果见表3，选择水油比为1∶3.

表3 水油比例的筛选结果(n=3)

4)交联剂用量的选择

结果见表4，选择交联剂的用量为0.3 mL.

表4 交联剂用量的筛选结果(n=3)

5)交联剂固化时间的选择

结果见表5，选择交联时间为3 h.

表5 交联时间的筛选结果(n=3)

6)药物用量的选择

结果见表6，选择槐定碱用量为40 mg.

表6 槐定碱用量的筛选结果(n=3)

7)乳化剂用量的选择

结果见表7，选择乳化剂用量为0.63 g.

表7 乳化剂用量的筛选结果(n=3)

3.2 正交设计实验结果

因素和水平见表8，实验结果见表9～12.

表8 正交设计因素水平表

表9 L9(34)正交设计表

表10 载药量方差分析表

表11 包封率方差分析表

表12 粒径方差分析表

结合表9、10结果，对R进行比较得到三种因素对槐定碱微球载药量的影响顺序为C>A>B，从载药量方差结果可知，因素A、B对壳聚糖微球无显著性(P>0.05)，C因素有显著影响性(P<0.05)，综合考虑，此时的最佳工艺为A3B2C1.

结合表9和表11结果，对R进行比较得到三种因素对槐定碱微球包封率的影响顺序为C>A>B，从包封率方差结果可知因素A、C对壳聚糖微球具有显著性(P<0.05)，B因素无显著影响性(P>0.05)，综合考虑，此时的最佳工艺为A3B2C1.

结合表9和表12结果，对R进行比较得到三种因素对微球粒径的影响顺序为C>A>B，从粒径方差结果可知因素C对壳聚糖微球粒径具有显著性(P<0.05)，因此当壳聚糖用量为50 mg时，粒径偏小，再结合包封率和载药量结果，综合考虑，最佳工艺为A3B2C1.

正交实验结果表明槐定碱微球的制备工艺为A3B2C1，即交联时间为3.5 h、乳化剂用量0.63 g、壳聚糖用量50 mg.

综上，槐定碱微球的制备工艺为：50 mg壳聚糖溶于稀释的醋酸水溶液中，搅拌混匀作为水相.司盘-80 0.63 g置于烧杯中，于40 ℃中搅拌均匀作为油相，将40 mg槐定碱溶解放入水相中，混匀后逐滴放入油相中，乳化30 min，加交联剂戊二醛0.3 mL，交联时间3.5 h，静止沉淀，弃上清液，用石油醚洗涤下层微球后干燥，即得槐定碱微球.

3.3 验证实验结果

按最终确定的制备工艺平行制备3组槐定碱微球，对载药量和包封率进行测量，用显微计数法计算粒径，结果见表13.结果表明，此方法重现性好.

表13 最优处方验证结果(n=3)

4 结 语

本实验选择生物相容性好、可降解型高分子材料作为载体将槐定碱制成槐定碱微球[12-14]，利用壳聚糖本身具有的生物活性，增加对器官的靶向性[15]，减少槐定碱对其他器官的毒性，可使药物在给药后到达靶器官缓慢持续释放，延长槐定碱在体内的半衰期，与注射液相比较能够减少用药周期，为槐定碱的给药提供可靠的缓释剂型，为中药有效成分的靶向缓释制剂的开发应用提供依据.