荷叶碱的分离纯化与HPLC检测

李 杨，吴 娇，朱钊铭，刘 骁，石玉生，李春斌

(1.大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连 116605;2.桂林医学院第二附属医院，广西 桂林 541199)

荷叶即睡莲科植物莲(NelumbonuciferaGaertn)的叶，其主要组成部分有叶片、叶柄和荷蒂(即叶片与叶柄相接的部分)。莲属植物虽然种类少但分布极其广泛，除青海、西藏等西北地区以外，全国各地均有分布，并主要集中在长江、黄河和珠江三大流域，其中以浙江、江苏、湖南、湖北等地为主。传统医学认为，荷叶性平、味苦，归脾、肝、胃经，具有清热解暑，凉血止血，生发清阳的功效[1]。《本草纲目》上有明确记载“荷叶服之，令人瘦劣，单服可消阳气浮肿之气”、“生发元气，禅助脾胃，涩精浊，散淤血，消肿痛，发痘疮”。在2002年初监发的中华人民共和国卫生部的卫法〔2002〕51号文件中，荷叶被列入“既是食品又是药品”的名单之中[2]。

荷叶碱(Nuciferine)是一种阿朴啡类生物碱，是荷叶生物碱中主要成分之一，在国际上规定 80%以上的纯度的荷叶碱即为高纯度荷叶碱，目前国内的荷叶碱制备水平较低，主要依赖国外进口高纯度荷叶碱[3]。高纯度荷叶碱晶体为白色，纯度越高颜色越接近白色，荷叶碱可溶于酸水，甲醇等有机溶剂，不溶于碱水，分子式 C19H21NO2，分子量 295.376[4]，结构式如图1。

图1 荷叶碱的化学结构式

荷叶生物碱大部分呈弱碱性，在水中的溶解性较差，一般以游离态的形式存在，但能很好地溶解于氯仿、乙醚、乙醇、甲醇等有机溶剂。由于生物碱在偏酸性条件下能生成可溶性盐，因此能溶于偏酸性的水溶液。在此前提下，荷叶中生物碱类物质的提取一般采用有机溶剂法，为了提高得率，一般辅助以超临界萃取、超声波萃取、微波萃取等方式。

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

实验原材料荷叶购于凤城市仁和中药饮片有限责任公司。实验过程中所用试剂均购于天津市科密欧化学试剂有限公司。

主要实验仪器：UV2450型紫外可见光谱仪(日本岛津)；IRPrestige-21型傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津)；LC-20AD型高效液相色谱仪(日本岛津)。

1.2 方 法

1.2.1 荷叶总生物碱的提取

根据生物碱适用酸提碱沉的原理，本实验中荷叶碱的提取采用了在50%乙醇提取溶液中加入稀盐酸调pH的方法[5]，用TLC法检测结果。

用电子天平准确称取20.0 g荷叶粉末，倒入两口圆底烧瓶中。用胶头滴管向50%乙醇溶液中缓慢滴加0.2%HCl溶液，调至pH=2.0，量取200 mL溶液倒入荷叶粉末中，60 ℃水浴回流提取2 h[6]。提取完成后，提取液过滤，保存过滤后的提取液，残渣按照上述步骤再次提取，收集合并提取液。提取液减压浓缩后得总生物碱浸膏[7]，称量得到的黑色浸膏为1.45 g，浸膏得率为7.25%。

以三氯甲烷：无水乙醇=10∶1为展开剂，以荷叶碱标准品作为对照进行TLC检测并记录。

1.2.2 荷叶碱的阳离子交换树脂纯化

据文献报道[8]，用离子交换树脂进行柱色谱分离荷叶碱效果较好，本实验先用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂进行荷叶碱分离的实验。

总生物碱浸膏用pH=2.0的50%乙醇溶液溶解，洗脱液为氨水：无水乙醇：去离子水=3∶40∶57。样品以5 ml·min-1的流速动态上样，用锥形瓶采集下方漏出液。上样完成后，用上述配制的洗脱液以5 ml·min-1的流速洗脱。待洗脱液有氨水味道时开始收集洗脱液，而且对洗脱液进行TLC检测。收集含有荷叶碱的洗脱液，以荷叶碱标准品为对照，进行紫外光谱检测。洗脱液经减压浓缩后得荷叶碱粗品，因荷叶碱粗品中还含有无机盐、蛋白质等杂质，需对粗品进行萃取，萃取溶剂为石油醚。用超声波清洗机进行萃取[9]，萃取时间为30 min，温度60 ℃，同样条件萃取两次，收集萃取液。

1.2.3 荷叶碱的大孔吸附树脂纯化

将荷叶总生物碱浸膏采用HPD-100大孔树脂进行柱色谱分离[10]，用50%～70%的乙醇溶液梯度洗脱。收集各梯度洗脱液并进行TLC检测，至洗脱液中加碘化铋钾无桔红色沉淀，减压浓缩成浸膏，得到纯化后的总生物碱。

1.2.4 荷叶碱的硅胶柱层析纯化

多次试验证明用树脂进行柱色谱分离并不能使荷叶碱单独分离出来，但是能得到初步纯化的总生物碱。因此在用树脂纯化获得总生物碱的基础上，对荷叶总生物碱进一步进行硅胶柱色谱的分离。

通过TLC法确定流动相及其比例为，二氯甲烷：甲醇=30∶1-20∶1。称取硅胶(100-200目)330 g，置于大烧杯中，用适量流动相浸泡，并用玻璃棒搅拌至无气泡，将硅胶倒入层析柱中，使硅胶床面平滑，流动相冲洗硅胶至干净[7]。将样品上样，加流动相进行洗脱，流速为3 ml·min-1。根据薄层板情况更换流动相比例，至洗脱液加入碘化铋钾无桔红色沉淀生成。

1.2.5 紫外吸收光谱的检测

准确称量荷叶碱标准品溶于一定量的乙醇溶液中，以乙醇为空白对照，在200～700 nm范围内进行紫外可见分光光度的扫描，将提取的样品的紫外扫描图谱与荷叶碱标准品的图谱进行比较与分析。

1.2.6 红外吸收光谱的检测

取KBr粉末200～250 mg在玛瑙研钵中充分研磨，将研磨好的物料置于压片模具中铺匀，合上模具置压片机上加压至80 MPa，压片3 min左，取少量配置好的0.1 mg·mL-1的荷叶碱标准品溶液均匀滴加在溴化钾片上，将样品架置于光谱仪中检测。荷叶碱提取物的检测方法同上，将提取的荷叶碱与标准品的红外光谱图进行对比与分析。

1.2.7 高效液相色谱的检测

(1)标准溶液配制。分别精密称取荷叶碱标准品和自制样品粉末2.50 mg，置25 mL容量瓶中，用乙腈(色谱纯)溶解并定容至刻度，其它几种低浓度的荷叶碱标准品用乙腈稀释制得。

(2)液相色谱条件。用于检测样品的色谱柱为OP C18-101002546柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相A：0.1%三氟乙酸溶液，B：乙腈[8]。梯度洗脱条件为：0～15 min B(20%～40%)，15～20 min B(40%～60% )，20～25 min B(60%～100%)。检测波长：270 nm，进样量：20 μL，流速：0.8 ml·min-1。

(3)检测样品溶液的准备。将定容后的荷叶碱样品在1 000 r·min-1，10 min条件下离心，取离心后上清液用2 mL的无菌注射器经0.22 μm微孔滤膜过滤，取过膜后的滤液作为液相检测溶液。

(4)流动相的准备。将三氟乙酸(色谱纯)按0.1%的比例加入到经0.45 μm微孔滤膜过膜后的超纯水中，乙腈和0.1%三氟乙酸溶液使用前需超声30 min。

2 结果与分析

2.1 荷叶碱提取结果

本实验提取的总生物碱经TLC检测有与荷叶碱标准品Rf值相同的点，均为0.6，证明用酸调节溶液的pH值有利于荷叶碱的提取。

2.2 不同纯化方法对荷叶碱分离纯化效果的影响

采用阳离子交换树脂、大孔吸附树脂以及硅胶柱层析法分别对荷叶碱进行纯化，经TLC检测后可知,虽然3中方法对荷叶碱都有一定的分离纯化作用，但对比之下硅胶柱层折法分离纯化效果最佳。

2.3 紫外吸收光谱的检测图谱与分析

荷叶碱标准品和样品的紫外吸收图谱如图2-3。

根据图2荷叶碱标准品的紫外吸收图谱可以看出，荷叶碱在270 nm处的吸光度值最大，而提取的样品经过紫外全波长扫描可以确定在270 nm处也有吸收，且峰型较为相似，由此可说明提取液中含有纯度较高的荷叶碱。

图2 荷叶碱标准品紫外谱图

图3 荷叶碱样品紫外谱图

由图2荷叶碱标准品的紫外吸收图谱可以看出，荷叶碱在270 nm处的吸光度值最大，而提取的样品经过紫外全波长扫描可以确定在270 nm处也有吸收，且峰型较为相似，由此可初步证明提取液中可能含有纯度较高的荷叶碱。

2.4 红外吸收光谱的检测图谱与分析

荷叶碱标准品和样品的红外吸收光谱图如图4-5。

图4 荷叶碱标准品红外谱图(KBr压片)

图5 荷叶碱样品红外谱图(KBr压片)

而由图4和图5的红外谱图可知，实验所得荷叶碱样品与标准品谱图的特征峰基本相符，主要特征峰的位置及峰型变化不大。

2.5 高效液相色谱的检测结果与分析

经多次检测确定荷叶碱在270 nm处有最大吸收峰，因此HPLC分析所选用的波长为270 nm，HPLC分析结果如图6-8。

图6 荷叶碱标准品液相谱图

图7 荷叶粗提液液相谱图

图8 荷叶碱样品液相谱图

如图6荷叶碱标准品的HPLC检测谱图所示，荷叶碱的保留时间为14.646 min。如图8所示的荷叶碱样品的HPLC检测谱图，荷叶碱的保留时间为14.736 min，与标准品基本一致。从高效液相色谱图可以看出，本实验购买的标准品含有一定量的杂质，也反应出纯化荷叶碱是个世界难题。本实验后续实验的荷叶碱标准品也需要在另外的公司重新购买，以便于实验能够顺利进行。

2.6 荷叶碱标准品的线性回归方程

本实验共配制了0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1以及0.10 mg·mL-1五个浓度，制作线性回归方程以液相谱图峰面积作为纵坐标(Y)，以荷叶碱标准品浓度作为横坐标(X)，结果见表1和图9，得线性回归方程y = 40 979x+6.993 9，R2=0.996 1 。由标准曲线表明，荷叶碱标准品溶液在 0.02～0.10 mg·mL-1的浓度范围内有较好的线性关系。

表1 荷叶碱标准品浓度与峰面积 /mAU

图9 荷叶碱标准曲线

荷叶碱样品的HPLC数据如下：

保留时间为14.736 min，峰面积为2 514.962 2，代入线性回归方程可得自制荷叶碱样品含量为0.061 2 mg·mL-1。

(1)

(2)

3 结 论

以荷叶为原料，研究了提取方法、提取溶剂的种类、浓度、pH、提取温度等对荷叶碱提取率的影响。用在冷凝回流前加入稀盐酸调节溶液pH至2.0的方法对荷叶碱进行提取，采用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂对荷叶碱进行了初步分离纯化，树脂洗脱液为3%氨水、40%无水乙醇和57%的水，洗脱速度为5 ml·min-1，然后采用硅胶柱层析的方法对荷叶碱再次进行分离纯化，所用硅胶为100-200目，流动相为二氯甲烷：甲醇=30∶1-20∶1。并用TLC法、紫外光谱法、红外光谱法以及高效液相色谱法对实验结果进行了检测。结果表明，pH为2.0的50%乙醇水浴回流法适于荷叶碱的提取，阳离子交换树脂和硅胶柱层析组合技术可分离纯化得到纯度为94.15%的荷叶碱，得率3.196%。