生物被膜对食品工业的危害与控制

李南薇，刘功良，高苏娟，白卫东，贾爱娟

1. 仲恺农业工程学院轻工食品学院（广州 510225）；2. 广东美味鲜调味食品有限公司（中山 528437）

长期以来，细菌被认为以浮游状态存在。随着电子扫描显微镜出现，发现大多数细菌在一定条件下会吸附在特定表面，并增殖形成群居膜状结构，这种由附着于载体表面的细菌细胞和包裹细菌的水合性基质所组成的结构性细菌群落被称为生物被膜（Biofilm）。生物被膜广泛存在于各种潮湿表面，是细菌粘附于载体表面生存时的一种特殊状态[1-3]。任何细菌在特定的条件下均能形成生物被膜，常见的被膜态致病菌包括单核细胞增生性李斯特菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、克雷伯氏肺炎杆菌和铜绿假单胞菌等[4]。

在自然环境中，生物被膜是多数细菌的温床，它赋予细菌对环境压力的抗性。生物被膜几乎存在于各种物体表面，如水槽表面、厨房角落、鱼缸内壁、空调冷凝水出水管内壁、动物表皮、牙齿、溪流中的小石块、船只、医疗器械、生产设备等，对日常生活产生广泛影响[5-6]。

食品加工的主要目的是为消费者提供美味、健康、安全的食品。食品安全是保护人类健康，提高人类生活质量的基础，无论是在发展中国家还是发达国家，人类健康均遭受着食源性疾病的威胁。据估计，每年全球大约三分之一的人有犯食源性疾病的经历。食源性病原菌是导致食物变质和引发食源性疾病的主要因素，也是食品安全要面对的长期难题。国内外过去的研究工作主要集中在食品中游离态致病致腐微生物上[7]。然而，越来越多研究表明，细菌生物被膜、亚致死细胞的修复及病毒的变异等问题是食品安全的重要隐性危害，也是导致食源性疾病爆发的重要原因[7]。据估计，65%～80%细菌性感染是由生物被膜引起的[8]。其中，食品工业中形成的生物被膜最有可能是食源性疾病的罪魁祸首。如在食品发酵中，一些腐败菌和病原菌会形成生物被膜，从而导致最终产品的腐败和疾病的爆发。因此，食品工业中生物被膜对食品安全的威胁不容忽视。

1 生物被膜的结构与特性

生物被膜结构复杂，且其结构、生理学特性和化学特性随着微生物种类和环境的变化而不同。通常，生物被膜主要由细菌、营养物质、细菌分泌的代谢产物及裂解产物和水等组成，其中水分可达97%，细菌分泌的胞外聚合物组分（EPS）主要包括蛋白质、胞外多糖、DNA和磷脂等生物大分子[1-2,9]。

大多数胞外多糖带负电荷，可从周围环境吸引各种有机物和无机物，故生物被膜的形态因细菌及环境的不同而异。如克雷白杆菌的胞外多糖复合物坚硬，且均匀分布于细菌表面，而铜绿假单胞菌表面则形成一种柔韧并有一定厚度的多糖蛋白复合物。然而，不同生物被膜的结构却惊人地相似，都由水化的多阴离子基质和包绕于其中的细菌所组成。生物被膜游离端由73%～98%细胞外物质和空隙组成，所以这种结构被形容为被膜“建筑物”[10]。

基于在生物被膜内位置的不同，可将细菌分为游离菌、表层菌和深层菌。处于生物被膜不同位置的细菌存在着生理状态、形态、代谢及基因表达等方面的差异。表层菌与游离菌比较相似，相对容易获得营养和氧气，代谢活动较旺盛，故菌体较大；深层菌由于处于生物被膜深处，营养物质贫乏，代谢废物浓度高，其养料的获取及代谢物的排出只能通过周围的水通道进行，在恶劣的生存条件下，会主动或被动地降低代谢活动，甚至转入休眠状态，一般不会频繁地分裂，菌体相对较小[11]。深层菌越接近吸附物体表面，pH和氧浓度较低，往往生长缓慢甚至不生长，通过降低自身代谢、节约能量、改变表现型、增强抗性和自身毒性，保护细胞免受环境压力改变的影响，并且增强抵抗抗生素、消毒剂及机体免疫系统的杀灭、吞噬作用等。更重要的是，微生物一旦形成被膜即可为细胞粘附提供新位点，使游离微生物个体不断粘附于被膜上；同时，个体也不断从被膜内释放或游离出来，使被膜成为慢性传染源[5,8]。

生物被膜作为一种特殊的细菌生长和生存方式，具有特点[12-13]：（1）生物被膜是细菌在自然界的主要存在形式，是不同于浮游菌的一种群体生长方式；据估计，在自然界超过90%的细菌是以生物被膜形式存在的。（2）生物被膜中的细菌群体是被细菌分泌的聚合物组分包裹的，生物被膜中生物体数量高于其它所有方式存在的生物体数量总和。（3）生物被膜内的细菌群体具有一定功能和组织。（4）生物被膜是细菌为适应环境的一种生命现象，在不利于其生长或存在条件下，细菌间相互粘连，并分泌聚合物基质形成膜状物；生物被膜中的细菌，具有更强的环境压力抗性。

2 生物被膜的形成过程

随着近年来透射电镜、扫描电子显微镜、原子力显微镜等先进仪器的应用，发现生物被膜的形成是一个动态过程，主要包括5个阶段[9,13-15]。

2.1 细菌定植

即细菌的初吸附。构成生物被膜的初始细胞仅有少量EPS，并且多数细菌能够借助菌毛独立运动。此阶段的吸附可逆，因为吸附的微生物还未进行分化，许多细菌可以从载体表面游离出来成为浮游菌。

2.2 粘附

即不可逆吸附过程。从可逆吸附过程转变为不可逆吸附，意味着在EPS存在条件下，细菌与载体表面的相互作用变强。细菌粘附在载体表面后，需要高强度的剪切力或者利用酶、去污剂、表面活性剂、消毒剂或者加热破坏细胞与载体表面的吸附才能除去生物被膜。被吸附细菌会产生一种多糖，增强细胞间的吸附作用。

2.3 微菌落的形成

微生物进一步生长繁殖，并聚集形成微菌落，同时产生EPS，增强细菌与基质间的键合作用，提高菌落对环境压力的抗性。通过细胞间化学信号的相互传递，微菌落不断从周围介质中吸纳浮游菌。微菌落的形成对于生物被膜的成熟非常有利，因为微菌落形成后，种群间即能进行养分交换，从而促进生物被膜的成熟。

2.4 分化成熟

经过不断分化成熟，微菌落依赖于养分的不同最终形成扁平状或蘑菇状的高度组织化结构。生物被膜完全达到成熟通常需要10 d或更长时间。成熟的生物被膜结构具有不均质性，由微菌落组成，微菌落之间围绕着水通道，可供运送养料、酶、代谢产物和排泄废物等。

2.5 播散

外部条件的改变如增强流体剪切力和生物被膜内部环境的变化如内部酶解的发生、EPS和表面键合蛋白的解离都可能导致生物被膜脱离。生物被膜的脱离是一个主动过程，因为这使得部分细菌离开菌群，并向远处播散继续分裂增殖，启动一个新的生物被膜形成过程。同时，饥饿也可能导致生物被膜脱落。脱落后，细菌可以寻找新的养分充足的环境。

3 生物被膜的危害

无论是在发展中国家还是发达国家，食品污染成为威胁公众健康的一个重要问题。据疾控中心报道，1996—2010年，在美国平均每年约1 000例食源性疾病爆发，导致4 800万人患病，12.8万人住院，3 000人死亡[16]。研究发现许多病原性疾病的爆发与生物被膜有很大关系。在美国，约80%的持续性细菌感染案例与生物被膜有关。

生物被膜是微生物为适应自然环境而特有的生命现象。生物被膜态微生物与常见的浮游态微生物相比有着显著的不同，表现为其抗性更强、危害更大，且更难清除[17]。据报道，生物被膜态菌对各种化学杀菌剂的敏感程度只是同种浮游菌的1/10～1/1 000。由于生物被膜态菌对消毒剂的抗性更强，故生物被膜给食品工业带来严重的食品安全问题。从食品生产到消费的各个阶段均可能感染微生物，特别是腐败菌和病原菌易粘附于食品表面，在食品加工系统中形成生物被膜。生物被膜一旦形成，不仅会污染食品、增加设备清洗难度，使就地清洗系统（CIP）失效，成为其他有害微生物的藏身之地，还会腐蚀食品加工和贮运设备，带来严重危害[16,18]。此外，生物被膜还会促使更多细菌协同共生，使设备内外表面成为传播食源性疾病的隐性生物危害源，导致难以解决的食品质量与安全问题[5,19]。

杨公明在主持“十五”国家苹果汁重大专项时，发现苹果浓缩汁生产线在开工1个月后几乎所有设定的CIP均不能保证自动清洗的质量，因此注意到生物被膜的危害，研究发现苹果浓缩汁产品中耐热菌超标是由于在超滤设备及生产线内部形成生物被膜从而大幅增强细菌对热及杀菌剂等的抵抗力，使原先设定的CIP无效；通过对CIP系统改进，这一问题才得以解决[7]。2008年加拿大Maple Leaf Foods公司曾因食品加工设备清洗不彻底，产品被单增李斯特菌污染，导致20余人死亡，直接经济损失5 000余万美元[5,20]。因此，食品加工过程中，生物被膜的控制和清除对保障食品安全尤为重要。

4 生物被膜的控制和清除

4.1 抑制生物被膜的形成

被膜态菌与浮游菌有着显著的不同，其抗性更强、更难清除且危害更大。因此，在生物被膜尚未形成前采取措施抑制生物被膜的形成是控制生物被膜的首选。生物被膜传感器可检测到物体表面的细菌群落，故可以在生物被膜成熟之前为其控制提供明确的指示。Pereira等[21]发明一种表面感应器，不仅能检测到形成初期的生物被膜，还能检测到清洗载体表面所用的试剂，识别出是何种清洗剂（生物或化学清洗剂），并计算出清除率。但在食品工业中，很难通过频繁消毒抑制生物被膜的形成，故选择不易形成生物被膜甚至能抑制生物被膜形成的材料作为食品加工接触表面是抑制被膜形成的重要途径。Rogers等[22]以自来水为唯一营养物质，研究8种不同管道材料上生物被膜的吸附情况，发现没有一种材料能完全抑制被膜的形成；其中，不锈钢片和聚丙烯管道上的生物被膜菌较少，而乳胶和乙丙橡胶管道上的生物被膜菌最多。Fujii等[23]对比研究金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和铜绿假单胞菌混合菌在包被共聚物（由2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸正丁酯组成）的不锈钢板和对照钢板上的生物被膜形成情况，发现包被共聚物的不锈钢板能抑制生物被膜的产生。近年来，一些含抑菌剂成分的食品包装材料在抑制食品表面病原菌和腐败菌的生长方面表现出广阔的应用前景。Knight等[24]发现含杆菌素的食品材料可有效抑制肉类加工中单核细胞增生性李斯特菌的吸附。Donlan[25]报道单核细胞增生性李斯特菌在含有尼生素的接触表面的污染概率远低于对照组。Davies等[26]发现抗生素和低电流联合作用产生的生物电效应可有效抑制生物被膜形成。

研究发现，某些化学试剂可显著抑制生物被膜的形成。Shanks等[27]研究柠檬酸钠浓度对抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响，发现浓度大于0.5%时，可有效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成；相反，浓度低于0.5%时，会促进大多数金黄色葡萄球菌菌株生物被膜的形成。Furukawa等[28]考察33种常用食品添加剂对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生物被膜的抑制作用，发现21种食品添加剂具有抑制生物被膜活性，其中蔗糖酯的抑制效果最好，且抑制效果随糖酯中脂肪酸碳链的增长而增强。但还没有一种方法能完全有效抑制生物被膜的形成[16]。

4.2 生物被膜的清除和杀灭

成熟生物被膜的清除通常是指利用物理或化学的方法破坏生物被膜的结构，使其从附着物表面脱落。在食品工业中，清洗和消毒对产品的品质极为关键[29-30]。Gibson等[31]发现高压喷射和机械地板洗涤器是清除生物被膜最有效的方法之一。表面活性剂或碱性化合物等化学试剂常用于清洗，它们通过减小表面张力、乳化脂肪、使蛋白质变性来悬浮或溶解食物残渣[32]。清洗过程必须能够有效破坏或溶解生物被膜的胞外多糖，从而为消毒剂提供接触深层菌的通道[16]。好的清洗工序尽管能去除90%甚至更多的微生物，但不能完全被杀灭。假以时日，微生物会重新吸附于载体表面，在富含水和营养物的条件下重新形成生物被膜。因此，清洗以后必须进行消毒[33]。

消毒即用消毒剂杀灭生物被膜中的微生物，目的是杀灭清洗后残留在载体表面的微生物，阻止其再次形成被膜。通常在缺乏有机物（如脂肪、碳水化合物、蛋白质等）条件下，消毒剂的灭菌效果更好。此外，有机物种类、pH、温度、水的硬度、化学抑制剂、消毒剂浓度及接触时间也是影响消毒效果的重要因素[34]。陈秋云等[35]研究二氧化氯对不锈钢表面的金黄色葡萄球菌生物被膜的灭菌效果，发现有效氯质量浓度100 mg/L时，作用15 min后，杀菌率100%；但是，有机营养物的存在会极大地降低二氧化氯的灭菌效果。Saitou等[36]研究酒精、冼必太、10%聚维酮碘、0.1%苯扎氯铵、0.1%烷基二甲基乙酸安泰乐和0.2%苯扎氯铵对铜绿假单胞菌生物被膜的杀灭效果，发现除0.1%烷基二甲基乙酸安泰乐外，其余5种杀菌剂对浮游菌的杀灭率几乎为100%；而对被膜态菌，只有0.1%苯扎氯铵的杀灭率不变，其余杀菌剂的杀菌效果均下降显著。

食品工业对杀菌剂的使用有严格的要求，杀菌剂必须安全、有效、使用方便、用完后能从载体表面去除、无毒性残留。但传统的化学杀菌剂只在高浓度、大剂量时才对生物被膜有较显著的杀灭作用，但高浓度、大剂量化学杀菌剂的使用对人类健康构成严重威胁。另外，一些细菌可能会通过基因突变等方式对杀菌剂产生一定抗性及生理塑性[16,37]。

近年来，植物来源的杀菌剂越来越受到人们的关注，因为天然杀菌剂对人体和动物相对安全。Nostro等[38]报道牛至精油和2种酚类化合物对金黄色葡萄球菌生物被膜的杀灭浓度分别为0.25%～1.00%和0.125%～0.5%，并且亚杀灭浓度的精油能抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。

酸性电解水是一种无色、透明、无明显刺激性气味的安全型消毒液，诞生于20世纪80年代后半期，用于杀灭耐甲氧四林的金黄色葡萄球菌。与传统杀菌剂比，酸性电解水具有杀菌效果好、成本低、环境友好等优点，被广泛应用于食品、农业、医疗、畜产、水产等领域[39]。研究表明酸性电解水能有效杀灭生物被膜[40]。

此外，一些生物法如酶法和噬菌体在去除生物被膜中逐渐受到关注。食品工业中，酶是一种用来消除生物被膜的绿色制剂。柴子涵[4]发现利用噬菌体聚糖酶对生物被膜进行预处理能显著提高二氧化氯对生物被膜的杀死率。酶可以通过降解EPS破坏生物被膜结构，使菌体释放出来，从而达到去除生物被膜目的。Orgaz等[41]研究来源于黑曲霉、木霉、青霉的酶去除细菌生物被膜的效果，发现以果胶为碳源，黑曲霉和青霉所产的酶可有效降解假单胞菌生物被膜，达到工业清洗的要求。如果辅助使用一些简单的物理或化学杀菌方法，能显著增强酶的作用效果。Oulahal-Lagsir等[42]发现联合使用紫外照射、蛋白酶及多糖降解酶能有效去除不锈钢表面的大肠杆菌生物被膜。联合使用酶和杀菌剂可显著提高生物被膜的去除率[43]。蛋白酶和表面活性剂的联合使用可增强生物被膜的润湿性，从而提高清洗效率[44]。多酶联合作用或与其他试剂协同作用是今后利用酶控制生物被膜的主要研究方向。

噬菌体在自然界中广泛存在，能侵染并破坏细菌，为生物被膜的控制提供一种专一、天然、灵敏、无毒的方法[45]。接触到被膜菌是噬菌体有效降解生物被膜的关键。许多噬菌体能产生胞外多糖降解酶或细胞溶解素，降解被膜菌的保护屏障，使噬菌体能够接触到细菌，并识别细菌表面受体，进而侵染并裂解被膜菌，从而达到较高的生物被膜降解率[46]。少量噬菌体在短时间内即可裂解细菌，并快速繁殖大量子代噬菌体，高效破坏生物被膜[47]。故噬菌体在生物被膜控制中的应用表现出广阔的应用前景。Sanna等[48]报道噬菌体phiIBB-PF7A可在短时间内高效破坏并除去荧光假单胞菌生物被膜。

5 展望

展示生物被膜在食品加工中的危害及其防治重要性，尽管抑制生物被膜的形成是食品加工过程中生物被膜控制的首选途径，但是由于生物被膜在自然界中广泛存在，并且其具有较强的环境抗性，故难以完全抑制生物被膜形成。生物被膜一旦形成，就必须使用各种方法清除并杀灭。从分子水平进一步研究生物被膜的形成机制、抗性机制，为实际生产中生物被膜的预防与控制提供理论依据和参考，从而保证食品安全和人体健康。