硫酯酶功能蛋白鉴定及催化规律的研究进展

王佳，孙子羽，满都拉，杨青，陈忠军

内蒙古农业大学食品科学与工程学院（呼和浩特 010000）

国家统计局公布2017年全国动植物油脂及其分解产品、精制的食用油脂、动植物蜡进口额为8 285 120万美元，其出口额为839 440万美元。我国国内对脂类产品有较高的需求，脂肪酸在食品、医药、化工等方面得到广泛的应用，在国民经济发展上具有不可替代的作用。

脂肪酸合成目前主要分为化学合成和微生物合成这两种方式。相比于化学合成，微生物合成有着反应条件温和、目标产物选择性强、前体物质可进一步合成下游产物等优点[1]，因此成为脂肪酸合成的研究热点。被誉为“天然汽油”的微生物脂肪酸不仅种类繁多，而且脂肪酸组成与植物油脂相似[2]。

脂质合成代谢是一种多种酶参与的生化反应，其中硫酯酶是细胞脂肪酸合成、降解和转运的关键酶，其活性决定机体代谢所产生的脂肪酸游离的形式。硫酯酶在生物合成脂肪酸过程中起到关键作用，深入研究硫酯酶功能及催化规律为解除脂酰辅酶A反馈阻遏奠定基础。

1 硫酯酶的作用和分类

硫酯酶广泛存在于动植物、微生物体内，能催化水解脂酰CoA和脂酰基-ACP生成辅酶A（CoASH/CoA）、脂酰基载体蛋白（Acyl carrier protein，ACP）以及其他含巯基的化合物，包括含有半胱氨酸残基的蛋白质和肽，同时释放出游离脂肪酸[3]。通过加强硫酯酶活性，促进脂酰CoA代谢，降低其累积量，从而提高了脂肪酸产量。硫酯酶的分类方式较多，可根据蛋白质中氨基酸序列或者底物的特异性等条件进行分类。目前较为认可的分类方法是以蛋白质一级结构中氨基酸的保守序列为主要分类标准，再参考硫酯酶的三级结构折叠域、折叠机制以及催化残基位点对其进行分类[5]。硫酯酶（Thioesterase，TE）分为从TE 1到TE 23，基本涵盖了所有类型的硫酯酶：酰基-CoA型（TE 1～13）、酰基-ACP型（TE 14～19）、聚酮型（TE 16，17）等[4]。

由于不同种类的微生物体中所含的硫酯酶的类型不同，常见的研究对象有原核微生物中大肠杆菌（革兰氏阴性菌）、谷氨酸棒状杆菌（革兰氏阳性）和放线菌浑浊红球菌（革兰氏阳性），以及真核微生物中酵母菌、高山被孢霉、微藻类。

2 原核微生物中硫酯酶的研究

基因工程是研究硫酯酶作用的普遍方式，其中大肠杆菌是最为常见的原核表达系统。Cao等[5]在大肠杆菌中表达拟南芥硫酯酶，其游离态脂肪酸的含量达到了总脂肪酸的37.5%；Voelker等[3]在大肠杆菌中表达加州月桂硫酯酶，重组菌中月桂酸超越棕榈酸成为了主要脂肪酸，占到总脂肪酸的50.95%，而正常情况下大肠杆菌不产月桂酸，可见硫酯酶的表达还能使重组菌产生新的脂肪酸。谷氨酸棒状杆菌作为发酵工程中重要的发酵菌种，也是硫酯酶研究的热点。浑浊红球菌是一种不仅对环境具有净化作用的放线菌，同时也是脂肪含量较高的原核微生物。

2.1 大肠杆菌

大肠杆菌中脂肪酸合酶属于典型的脂肪酸合酶（the fatty acid synthesase，FAS）Ⅱ系，它包括一系列酶分别独立催化不同的反应。大肠杆菌硫脂酶主要以脂酰辅酶A 为水解底物，释放出游离脂肪酸，同时能水解脂酰-ACP。在大肠杆菌中通过鉴定和表征研究的长链酰基辅酶A硫酯酶有硫酯酶I和硫酯酶Ⅱ，以及参与β氧化的硫酯酶Ⅲ。

2.1.1 硫酯酶Ⅰ

硫酯酶Ⅰ为周质酶，对细胞溶质中脂肪酸合成的作用不显著。硫酯酶Ⅰ由具有催化三联体Ser10-Asp154-His157的TesA基因编码，属于专一性水解12～18碳的脂酰辅酶A 。该酶的催化机制是丝氨酸残基中羟基在组氨酸残基的作用下亲核攻击酰基-ACP和酰基辅酶A的硫酯键[6]。Steen等[2]在大肠杆菌中表达内源硫脂酶基因TesA，在摇瓶发酵的条件下游离脂肪酸含量为0.32 g/L。

’TesA（硫酯酶TesA删除前导肽序列）可通过水解长链酰基-ACPs来增强FAS活性[3]，从而解除长链酰基-ACP对脂肪酸合成的抑制作用。当’TesA与其底物相互作用时，开关环（残基75～80）的移动通过稳定Michaelis复合物（MC）来影响底物特异性[7]。

在脂肪酸合成过程中，一定比例的’TesA与FAS组分对底物酰基-ACP具有积极作用，降低FAS酶的反馈抑制。’TesA的另一种底物是酰基辅酶A，它抑制Ⅱ型脂肪酸合酶FabI的活性，’TesA在脂肪酸延伸中起关键作用。通过催化活性的’TesA的表达可以增加FFA产量，而’TesA的过度表达不具有这样的作用[8]。

2.1.2 硫酯酶Ⅱ

硫酯酶Ⅱ是一种由TesB基因编码的细胞溶质酶，对底物具有高活性，专一性水解6～18碳的脂酰-CoA。TesB和phaG基因之间具有相互调节作用，在大肠杆菌中共表达TesB和phaG基因，可促进重组菌3-羟基癸酸的生产[9]。

2.1.3 硫酯酶Ⅲ

硫酯酶Ⅲ是一种具有hotdog折叠的同型三聚体的长链酰基辅酶A硫酯酶，其对3, 5-十四碳二烯酰-CoA（油酸β氧化的次要代谢产物）最具活性。硫酯酶Ⅲ是一种相对疏水的可溶性蛋白质酶，其理论分子量为15-kDa单体。当油酸作为唯一碳源时，大肠杆菌中大部分脂肪酸在硫酯酶Ⅲ水解作用下进行β氧化至完全降解，仅约10%的油酸降解成3, 5-顺式-十四碳二烯-CoA[10]。

2.2 谷氨酸棒状杆菌

谷氨酸棒杆菌具有I型脂肪酸合成酶，革兰氏阳性菌，由于其细胞壁不含脂多糖，所以有利于产物游离脂肪酸的分离纯化。在谷氨酸棒杆菌中，硫酯酶参与酰基辅酶A的裂解，从而生成游离脂肪酸[11]。

野生型谷氨酸棒杆菌中硫酯酶活力比大肠杆菌中硫酯酶活力高出16倍左右，且其胞内不存在降解脂肪酸的β氧化途径，有利于游离脂肪酸的合成与积累。Seiki等[12]通过高通量筛选获得一株具有较高脂肪酸合成能力的谷氨酸棒杆菌突变株PCC-6，与野生型菌株相比，其脂肪酸产量由3.21 mg/L提高至279.95 mg/L，脂肪酸产量显著提高。谷氨酸棒杆菌中可能存在三个脂酰CoA硫酯酶，其具体的分类以及作用待研究。

2.3 浑浊红球菌

浑浊红球菌从土壤中分离得到，属于放线菌，革兰氏阳性菌，可以分解有毒物质，是一种具有生物净化污染土壤、合成生物能源的潜力菌株。此菌株是具有I型脂肪酸合成途径的高产油脂微生物[13]。

浑浊红球菌PD 630在不同碳源条件下，合成脂质积累量不同。Alvarez等[14]发现脂质产量最高的培养条件是以橄榄油为碳源，脂肪酸总量可占菌体干质量高达87%。

野生型浑浊红球菌PD 630在发酵培养过程中，其内源的四个硫酯酶基因表达水平随发酵时间呈现不同的趋势，其中TE2和TE4基因的表达水平随菌体产脂速率的增加而增加，当菌体进入稳定期后产脂速率快速降低时，两者基因的表达水平也降至较低值；而TE1和TE3基因的表达水平则与菌体产脂没有显著相关性[13]。

3 真核微生物中硫酯酶的研究

目前分离出的真核生物硫酯酶，一般会通过基因工程技术转化在酵母表达系统中，进一步研究其活性和作用。Stefan等[15]在耶氏解脂酵母中表达萼距花的硫酯酶CpFatB2，发现不仅提高了其总脂的含量，而且提高了不饱和脂肪酸的含量，其中油酸的含量占总脂肪酸的60%。郝昭程等[16]在毕赤酵母中表达拟南芥硫酯酶AtFatA后，显示胞外游离态脂肪酸中的中链脂肪酸增加了51%，主要是辛酸。高山被孢霉作为高产脂质的菌种，其硫酯酶研究是一大热点。微藻类作为光合自养的低等植，高山被孢霉作为高产物，其TE对调节脂肪酸组成的作用比较显著。

3.1 酵母

作为油脂生产菌种，圆红冬孢酵母在发酵罐水平上可获得0.535 g油脂，包含35%饱和脂肪酸、46%的单不饱和脂肪酸以及其余多种多不饱和脂肪酸[17]；解脂耶氏酵母油脂含量可达到其自身细胞干质量的50%以上；通过引入异源腺嘌呤核苷三磷酸-柠檬酸裂解酶途径、优化关键代谢基因以及敲除竞争途径的相关基因的方式，酿酒酵母在生产脂肪酸产量方面有着明显的提高[18]。

酿酒酵母菌株△faa1△faa4，含有一种编码短小的过氧化物酶体肌acyl-CoA TE的Acot5s基因，过表达此基因，游离脂肪酸（the free fattyacid，FFA）水平显著提高。与野生型（the wild type，WT）菌株相比，工程菌株△faa1△faa4和△faa1△faa4[Acot5s]的细胞外脂肪酸显著增加，表明硫酯酶Acot5s对FFA积累具有直接影响[19]。

酿酒酵母菌株△faa1△faa4[Acot5s]中胞浆酰基CoA硫酯酶Acot5s的表达使总游离脂肪酸（FFA）产量增加至约500 μg/mL，与WT相比增加了6倍以上。Acot5s是一种非常有效的酶，可将酰基CoA转化为游离脂肪酸（FFA）。硫酯酶的表达增强了脂肪酸转运能力，影响了关键代谢途径中涉及的蛋白质的调节，从而导致主要的代谢重排，但同时不损害菌体的生长[20]。

3.2 油脂真菌高山被孢霉

高山被孢霉是一种高产脂质的丝状真菌，其总脂的积累量可以达到细胞干质量的50%。它通过美国食品药物管理局的安全性评估，既可作为食品级的工业产油微生物，也是脂质生物化学基础研究的重要模式微生物[21]。

在油脂真菌高山被孢霉中有Acot8和Acot9两种编码硫酯酶的基因。Acot8是在羧基末端含有I型过氧化物酶体靶向信号并且位于过氧化物酶体中，而Acot9是线粒体硫酯酶，具有从细菌到人类的同源基因[22]。

Acot8酶可能对作为底物的CoA部分识别力较高，对硫酯化的酰基链敏感度较低。在油脂真菌高山被孢霉细胞内脂质代谢中，过表达酰基CoA硫酯酶Acot8I时，重组菌株中总脂肪酸（the total fattyacid，TFA）含量与野生型高山被孢霉相同，游离脂肪酸（the free fattyacid，FFA）的产量从约0.9%（野生型）增加到2.8%（重组）。重组菌株中FFA含量中约为TFA的9%，而野生型油脂真菌高山被孢霉中含量约为TFA的1.3%；FFA中γ-亚麻酸和花生四烯酸含量分别约占4%和25%，而在野生型高山被孢霉中均未被检测到。在油质真菌高山被孢霉中过表达Acot8I，增强了从酰基CoA到FFA的通量，改善了FFA的产量并调整了脂质种类[23]。Acot8I对2～20个碳原子的酰基CoA具有异常广泛的底物特异性[24]。

4 真核微藻

微藻是一类光合自养的低等植物，胞内脂质含量超过细胞干质量的20%，通过遗传转化的方法提高微藻的含油量，使其含油量超过干质量的80%以上，大多数含油微藻可以合成C16～C18脂肪酸[25]。在脂质研究中，常见的真核微藻主要有红球藻、莱茵衣藻、三角褐指藻等，研究发现三角褐指藻的TE基因与植物FatA基因更相似。

TE表达与雨生红球藻中脂肪酸合成之间存在线性相关性，TE在脂肪合成中处于关键的一步。Tan等[26]将杜氏盐藻中TE引入莱茵衣藻，干质量中总脂质含量增加至15%，比野生型高56%。

将来自其他生物的TE基因转化到微藻中，不仅可获得目的油脂，还可以改善微藻的脂肪酸。例如Radakovits等[27]将来自香樟肉桂和加州月桂的两种能合成特异性短链脂肪酸的TEs转化到三角褐指藻中，发现C12∶0和C14∶0的百分比增加。由于异源TE对莱茵衣藻的ACP具有较低的亲和力，来自植物C8～C12特异性TE引入莱茵衣藻时，未观察到脂肪酸的变化，但是来自植物的C10～C14特异性TE基因被引入莱茵衣藻时，增强了C10～C14脂肪酸积累量[41]。TE的作用不仅仅在于脂肪酸的积累，更重要的是在调节脂肪酸的组成。

5 讨论与展望

微生物的脂质代谢对于脂肪酸工业意义十分重大，掌握微生物脂质代谢规律更有利于进一步的研究。在脂肪酸合成过程中，脂酰CoA过量累积会起到反馈抑制作用，导致脂肪酸产量降低。硫酯酶不仅可以缓解脂酰CoA的反馈抑制作用，而且能促进脂肪酸的合成，还对生成脂肪酸种类、促进脂肪酸分泌于体外等相关功能有着重要的作用。

原核微生物不同菌种中其脂肪酸合成途径也不同，基本分为FAS Ⅰ和FAS Ⅱ两种系统。大肠杆菌是典型的FAS Ⅱ系统，谷氨酸棒状杆菌和浑浊红球菌是FAS Ⅰ系统，不同的脂肪酸合成系统对应的特点也不同。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，谷氨酸棒状杆菌和浑浊红球菌是革兰氏阳性菌，浑浊红球菌属于放线菌属，这三种原核微生物体内的硫酯酶的作用既有相同点也有较大的区别。

目前大肠杆菌的脂肪酸合成代谢研究比较清楚，对应的硫酯酶分类和作用也相对清晰，不仅含有TesA、TesB基因编码的硫酯酶Ⅰ和Ⅱ，同时也含有β氧化中起到重要调节作用的硫酯酶Ⅲ。棒状杆菌具有I型脂肪酸合成酶（FAS），由一种酶超复合物进行脂肪酸合成的连续循环，谷氨酸棒状杆菌就是这种类型的菌种，与其他菌种相比，谷氨酸棒状杆菌硫酯酶活性比较强。浑浊红球菌在不同碳源的底物情况下，所合成的脂肪酸含量和种类也不同，作为高产脂质的菌种，其体内含有四种硫酯酶，其活性和作用位点不同，可分解的底物也不尽相同。

在真核微生物中，对酵母应用于生产脂肪酸方面的研究较多，不同的外源硫酯酶在酵母体内表达并能发挥其作用。真菌也应用于脂肪酸的研究，其中高山被孢霉最为突出。微藻作为低等植物，在改善脂质质量上有着不可替代的作用。

在酵母菌中ACOT 5s硫酯酶不仅对脂肪酸的合成而且对脂肪酸分泌具有促进作用；高山被孢霉体内的ACOT 8所编码的硫酯酶不仅提高了脂肪酸含量而且增加了脂肪酸种类；在微藻类中引入不同的外源植物硫酯酶基因，不仅可以获得较多种类的中链脂肪酸，而且能改善微藻脂质质量。

在以增加脂肪酸产量为目的的研究中，探讨硫酯酶的功能蛋白鉴定及催化规律，在微生物合成脂肪酸中起着积极的作用。不同种类的硫酯酶调控不同的脂质合成代谢途径。硫酯酶在脂质代谢中，不仅对脂肪酰基CoA具有水解催化作用，还对脂肪酸的种类、转移、分泌等过程具有不同程度的影响。随着对硫酯酶的深入研究，将会为提高脂肪酸产量提供更多的可能。