苦瓜双色平脐蠕孢叶斑病病原菌的生物学特性及其抑菌药剂筛选

秦健 黄如葵 黄熊娟 刘杏连 梁家作 琚茜茜 黄玉辉

摘  要：为了明确苦瓜双色平脐蠕孢叶斑病菌（Bipolaris bicolor）的生物学特性及其对杀菌剂的敏感性，研究了不同培养条件对该病原菌菌丝生长的影响，并测定了10种杀菌剂对该病原菌的抑制作用。结果表明：该病原菌菌丝生长最适温度为25～30 ℃，最适pH范围为6～7，适宜培养基为马铃薯蔗糖培养基（PSA）和玉米粉培养基（CMA），持续黑暗和光暗交替有利于菌丝生长;不同碳源和氮源对菌丝生长的影响差异显著，其中葡萄糖和蛋白胨分别为最适碳源和氮源，菌丝生长致死温度为45 ℃。250 g/L苯醚甲环唑乳油毒力最强，EC50为0.0233 mg/L，其次为250 g/L吡唑醚菌酯悬浮剂、20%抑霉唑水乳剂和50%嘧菌环胺水分散粒剂。

关键词：苦瓜;叶斑病;双色平脐蠕孢;生物学特性;毒力

中图分类号：S436.429      文献标识码：A

Abstract： To clarify the biological characteristics and sensitivity to different fungicides， the effects of different culture condition on the mycelial growth of Bipolaris bicolor were determined. The inhibitory activity of ten fungicides on B. bicolor were also studied. The optimum temperature and pH for the mycelial growth was 25-30 ℃ and pH 6-7， respectively. PSA and CMA medium were the appropriate medium for hyphal growth. Continuous darkness condition and the alternation of light and darkness were beneficial to mycelial growth. Effects for carbon and nitrogen sources on mycelial growth were significantly different， and the optimal carbon and nitrogen source was dextrose and peptone， respectively. The lethal temperature of mycelia was 45 ℃. The toxicity test showed that 250 g/L difenoconazole EC had the highest inhibitory activity with EC50 of 0.0233 mg/L among all fungicides， followed by 250 g/L pyraclostrobin SC， 20% imazalil EW and 50% cyprodinil WDG.

Keywords： Momordica charantia; leaf spot; Bipolaris bicolor; biological characteristics; toxicity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.019

[]苦瓜（Momordica charantia L.）是重要的藥食兼用作物，苦瓜常见病害有白粉病、枯萎病和炭疽病等[1-3]，近年来，苦瓜蔓枯病时有发生[4]。近期，笔者在广西南宁苦瓜基地发现一种苦瓜新的叶斑病，该病发生于苦瓜盛瓜期，发生率为3%～25%，该病害病斑刚开始表现为水渍状小圆斑，严重时病斑扩大，引起叶片萎蔫，死亡，严重影响苦瓜植株生长。通过对病原菌的分离、纯化、致病性测定，得到苦瓜叶斑病的致病菌株，命名为YB450101，观察该菌株的菌落形态、孢子和孢子梗等特征，结合ITS-TEF-GPD基因测定结果将该病原菌鉴定为双色平脐蠕孢菌（Bipolaris bicolor）[5]。

随着作物栽培面积的增大，病虫害发生为害的概率也相应地增加。双色平脐蠕孢菌可以为害橡胶树[6]、桃棕[7]、小麦[8]和牛筋草[9]等作物，但是，侵染苦瓜为首次报道，目前该病菌的生物学特性和药剂筛选也未见报道。本研究开展双色平脐蠕孢菌的生物学特性和室内杀菌剂毒力研究，建立基础数据库，为该病害综合防控提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试病原菌  广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所实验室保存的双色平脐蠕孢菌（Bipolaris bicolor），命名为YB450101[5]。

1.1.2  供试药剂  室内药剂毒力测定所用杀菌剂均为市售品种，具体信息见表1。

1.1.3  供试培养基  马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、马铃薯蔗糖培养基（PSA）、察氏培养基（Czapek）、燕麦片培养基（OMA）、玉米粉培养基（CMA）、碳或氮源基础培养基和水琼脂培养基（WA）[10]。

1.2  方法

1.2.1  病原菌生物学特性的测定  温度对菌丝生长的影响：用打孔器打取菌块（d=7 mm），转接到PDA平板上，分别置于5、10、15、20、25、28、30、35 ℃恒温培养箱中培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3次，详情参考郑丽等[11]的方法。

pH对病原菌菌丝生长的影响：用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液将PDA培养基的pH分别调配成4、5、6、7、8、9、10、11，采用上述接种方法，每个处理重复3次，28 ℃恒温培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径，详情参考康迅等[10]的方法。

碳（氮）源对菌丝生长的影响：用含有相同碳元素质量的蔗糖、可溶性淀粉、果糖、乳糖、麦芽糖、木糖、山梨醇置换基础培养基中的葡萄糖，配制成不同碳源培养基。用含有相同氮元素质量的氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、甘氨酸、半胱氨酸、尿素、蛋白胨、牛肉浸膏置换基础培养基中的硝酸钾，配制成不同氮源培养基。采用上述接种方法，每个处理重复3次，28 ℃恒温培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径，详情参考康迅等[10]的方法。

光照对菌丝生长的影响：设24 h全光照、12 h光照+12 h黑暗及24 h全黑暗3种处理，采用上述接种方法，每个处理重复3次，28 ℃恒温培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径，详情参考康迅等[10]的方法。

培养基对菌丝生长的影响：采用上述接种方法，接种于PDA、PSA、Czapek、OMA、CMA的平板中央，以WA平板作对照，每个处理重复3次，28 ℃恒温培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径，详情参考康迅等[10]的方法。

病原菌菌丝致死温度的测定：在灭菌的5 mL试管中加无菌水2 mL，分别加热到40、45、50、55、60、65 ℃，将菌块（d=7 mm）分别放入以上处理后的试管中并摇匀，处理10 min后取出试管冷却至室温，再将菌块接种到PDA平板中央，以28 ℃为对照（CK），每个处理重复3次，28 ℃恒温培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径，详情参考康迅等[10]的方法。

1.2.2  病原菌室内药剂筛选  采用菌丝生长速率法测定菌株对不同药剂不同浓度的敏感性[12]。具体方法如下：称取一定量的药剂，加入无菌水，配制成某个浓度的母液，用移液枪取一定量母液加入到一定体积的PDA培养基中，配制5个浓度（有效成分浓度）梯度的含药培养基平板，然后从纯化的菌落边缘打取菌饼（d=7 mm），接种，并以不含药剂的处理为对照，28 ℃恒温培养，菌落直径为培养皿的2/3时，即測量菌落直径，并计算抑菌率。每个处理4个重复。将药剂浓度（mg/L）转换成以10为底的对数值（x），菌丝生长抑制率换算成几率值（y），并用DPS软件求出各供试药剂的毒力回归方程、有效抑制中浓度（EC50）及相关系数r。

1.3  数据处理

采用Microsoft Excel软件和DPS软件对实验数据进行处理和统计分析。

2  结果与分析

2.1  病原菌的生物学特性分析

2.1.1  温度对病原菌菌丝生长的影响  试验结果表明，在15～35 ℃范围内，病原菌菌丝均能生长。当温度低于10 ℃时，菌丝停止生长，25～30 ℃生长最快，28 ℃时菌落直径达78.50 mm。表明该病原菌最适生长温度为25～30 ℃（图1）。

2.1.2  pH对病原菌菌丝生长的影响  不同pH对菌丝生长有不同程度的影响（图2）。病原菌在pH为4～11的范围内，其菌丝均能生长。但是，当pH为4时，菌丝生长最缓慢，显著慢于其他处理，菌落直径仅为8.00 mm;pH为5或11时，菌丝生长也较为缓慢，菌落直径为13.80～18.50 mm;pH为6或7时，菌丝生长最适宜，菌落直径达62.80 mm或60.50 mm。适宜菌丝生长的pH范围为6～9，最适pH为6～7。

2.1.3  碳（氮）源对病原菌菌丝生长的影响  不同碳源对病原菌菌丝生长的影响存在较大差异（图3）。葡萄糖利用率最高，菌落直径达79.20 mm，与果糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖和蔗糖相比未达差异显著水平，但均显著高于山梨醇中的菌落直径。所以，葡萄糖是最有利于病原菌菌丝生长的碳源。

不同氮源对病原菌菌丝生长的影响也存在较大差异（图4）。半胱氨酸、甘氨酸和氯化铵均不利于菌丝生长，其菌落直径显著低于其他处理。病原菌对蛋白胨利用率最高，菌落直径为63.17 mm，其次为硫酸铵。由此可见，蛋白胨是最有利于病原菌菌丝生长的氮源。

2.1.4  光照对病原菌菌丝生长的影响  光照处理后，不同光照条件对病原菌菌丝生长略有差异（图5）。在光暗交替或连续黑暗的条件下，病原菌的菌落直径相当，在64.25～64.30 mm之间，并显著高于连续光照的处理。因此，光暗交替或者连续黑暗更有利于病原菌的生长。

2.1.5  培养基对病原菌菌丝生长的影响  不同培养基对病原菌菌丝生长存在一定影响（图6）。病原菌在PSA培养基上生长最好，菌落直径达80.00 mm，但与CMA培养基上的菌落直径相比未达差异显著水平，OMA、Czapek和PDA培养基在生物统计学上处于同一水平并显著高于WA培养基的菌落直径。因此，PSA和CMA培养基最有利于病原菌菌丝生长。

2.1.6  病原菌菌丝致死温度的测定  不同温度对病原菌菌丝生长的影响见图7。病原菌在超过45 ℃的水浴中处理10 min后，病原菌基本不能生长。由此说明，病原菌的致死温度为45 ℃。

2.2  不同药剂对病原菌的抑菌效果

10种杀菌剂的毒力测定表明，不同杀菌剂对病原菌的毒力存在差异（表2）。其中，250 g/L苯醚甲环唑乳油毒力最强，EC50为0.0233 mg/L，其次为250 g/L吡唑醚菌酯悬浮剂、20%抑霉唑水乳剂和50%嘧菌环胺水分散粒剂，EC50分别为0.0246、0.0400和0.0518 mg/L。而23.4%双炔酰菌胺悬浮剂毒力最差，EC50为20.4604 mg/L，其余药剂的EC50为0.2086～1.5296 mg/L。

3  讨论

双色平脐蠕孢菌可以侵染橡胶树[6]、桃棕[7]、小麦[8]和牛筋草[9]等植物，然而侵染苦瓜，国内外尚属首次报道，该病菌的生物学特性和药剂筛选也未见报道。该病害为害苦瓜，发生率为3%～25%，随着苦瓜栽培面积的扩大，病菌的快速繁殖，该病害将会有大面积发生的趋势。因此，开展该病害的生物学特性和药剂筛选研究，了解病菌生长的环境条件，明确对病原菌具有较好防治效果的药剂，从而制定相应的防治措施，对于防控该病害具有重要的意义。

本文对苦瓜叶斑病病原（Bipolaris bicolor）进行生物学特性测定。结果表明，该病原菌菌丝生长最适温度为25～30 ℃，与狗牙根平脐蠕孢（B. cynodontis）[13]和稻平脐蠕孢（B. oryzae）[14]的结果相似，这与南宁地区5—9月病害发生为害直接相关;在pH为4～11的范围内，其菌丝均能生长，其中最适pH范围为6～7，说明，弱酸碱至中性的环境条件下利于菌丝生长，与小麦根腐病菌（B. sorokiniana）[15]的结果相似;在马铃薯蔗糖培养基和玉米粉培养基中菌丝生长最快，碳源和氮源利用率最高为葡萄糖和蛋白胨，这与狗尾草平脐蠕孢（B. setariae）[16]的结果相似。持续黑暗和光暗交替有利于B. bicolor菌丝生长，说明菌丝生长对光照的要求不高;B. bicolor菌丝生长致死温度为45 ℃，低于B. sorokiniana和B. setariae的致死温度，说明B. bicolor对高温比较敏感。

通过对苦瓜叶斑病病原菌的室内药剂筛选试验，发现250 g/L苯醚甲环唑乳油毒力最强，EC50为0.0233 mg/L，其次为250 g/L吡唑醚菌酯悬浮剂、50%嘧菌环胺水分散粒剂和20%抑霉唑水乳剂。EC50数值越小，毒力回归方程的斜率越大，表明随着浓度的增大，该药剂的抑制效果越明显[17]。23.4%双炔酰菌胺悬浮剂斜率较小，EC50数值较大，说明该药剂抑菌效果较差。冯思琪[18]、房宽峰[19]、郭炜[20]研究发现苯醚甲环唑对B. oryzae、B. australiensis、B. sorokinianum具有很好的抑制效果，说明三唑类（苯醚甲环唑）杀菌剂可能对平脐蠕孢属普遍具有较强的抑制作用。另外，甲氧基丙烯酸酯类（吡唑醚菌酯）和嘧啶胺类（嘧菌环胺）杀菌剂对病原菌B. bicolor也具有很好的抑制作用。

此次药剂筛选试验，获得了抑菌效果较好的3种不同类型药剂，这对于防控该病害具有一定意义。但是，本研究仅为室内平板试验，由于田间生产中，药剂的防治效果容易受到施药时期、气候、药械和其他不可预计的因素的影响，因此，需要再进行田间防效试验，以确定哪些药剂为田间防治该病害的首选药剂。

参考文献

周萌萌， 田丽波， 商  桑， 等. 苦瓜白粉病病原菌和生理小种的鉴定及苦瓜对白粉病的抗性遗传分析[J]. 植物保护学报， 2019， 46（2）： 313-322.

陈振东， 袁高庆， 黎起秦， 等. 苦瓜枯萎病菌的鉴定及其遗传多样性分析[J]. 植物病理学报， 2014， 44（1）： 36-45.

王会芳， 曾向萍， 芮  凯， 等. 苦瓜炭疽病病原鉴定及生物学特性初步研究[J]. 中国农学通报， 2011， 28（7）： 141-145.

秦  健， 陈振东， 宋焕忠， 等. 广西苦瓜蔓枯病的病原分离与鉴定[J]. 植物病理学报， 2018（2）： 280-284.

秦  健， 黄如葵， 陈振东， 等. 苦瓜平脐蠕孢叶斑病病原鉴定[J]. 植物病理学报，2019， 49（5）： 711-714.

Liang X Y， Peng Y， Liu Y C， et al. First report of Bipolaris bicolor causing a leaf spot disease on rubber tree[J]. Journal of Phytopathology， 2019（2）： 1-5.

Rodríguez-Morejón K， Kimati H， Fancelli M I. Bipolaris bicolor （Mitra） Shoemaker： Species associated to folial spot in pupunha palm （Bactris gasipaes Kunth） in Brazil[J]. Revista Iberoamericana de Micología， 1998， 15（1）： 55-57.

Morejon K R， Moraes M H D， Bach E E. Identification of Bipolaris bicolor and Bipolaris sorokiniana on wheat seeds （Triticum aestivum L.） in Brazil[J]. Brazilian Journal of Microbiology， 2006， 37（3）： 247-250.

Marin Y， Cheewangkoon R， Crous P W. New species and records of Bipolaris and Curvularia from Thailand[J]. Mycosphere， 2017， 8（9）： 1556–1574.

康  迅， 靳鹏飞， 冯  霞， 等. 辣木枝枯病病原菌鑒定及其生物学特性[J]. 植物保护学报， 2017， 44（3）： 481-487.

郑  丽， 张海鹏， 林  江， 等. 油棕草茎点霉叶斑病病原菌的生物学特性和毒力测定[J]. 热带作物学报， 2017， 38（9）： 1694-1699.

徐汉虹. 植物化学保护实验指导[M]. 2版. 北京： 中国农业出版社， 2012： 48-49.

杨成德， 陈秀蓉， 薛  莉， 等. 牧草根际狗牙根平脐蠕孢菌的研究[J]. 草业学报， 2008（3）： 86-92.

张建萍， 周勇军， 韩  川， 等. 六蕊假稻病原菌稻平脐蠕孢菌生物学特性研究[J]. 中国农学通报， 2014， 30（36）： 124-127.

刘正坪， 王立新， 李荣禧， 等. 小麦根腐病菌鉴定及其生物学特性测定[J]. 华北农学报， 2002， 17（2）： 44-48.

牛晓庆， 余凤玉， 朱 辉， 等. 椰子平脐蠕孢叶斑病病原鉴定及生物学特性测定[J]. 热带作物学报， 2015， 36（3）： 581-586.

郑  丽， 杨  威， 覃新导， 等. 锯叶棕苗期叶斑病菌（Calonectria pteridis）生物学特性及其对11种杀菌剂的毒力反应[J]. 热带作物学报， 2014， 35（8）： 1625-1631.

冯思琪. 水稻胡麻叶斑病菌生物学特性、药剂筛选及品种抗性分析[D]. 大庆： 黑龙江八一农垦大学， 2019.

房宽锋. 高尔夫球场狗牙根叶斑病病原学的研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2006.

郭  炜. 西北地区冬小麦普通根腐病和茎基腐病病原鉴定及种质资源抗性筛选[D]. 兰州： 甘肃农业大学， 2018.